Metodeutvikling og validering av real-time PCR for deteksjon av bac gen hos Streptococcus agalactiae

Abstract

Streptococcus agalactiae omtales ofte som gruppe B streptokokker (GBS) og er en av de vanligste årsakene til infeksjonssykdom hos nyfødte. Ved Nasjonalt referanselaboratorium for GBS ved St.Olavs Hospital overvåkes serotyper og subtyper av GBS. Dette er for å kunne avdekke eventuelle utbrudd og for å vite hvilke serotyper og subtyper som finnes i befolkningen til enhver tid. Formålet med bacheloroppgaven var å etablere en real-time PCR-metode for deteksjon av bac-genet hos GBS. I dag anvendes konvensjonell PCR for deteksjon av bac-genet, noe som er tidkrevende for bioingeniørene som jobber ved referanselaboratoriet.

Utvikling av real-time PCR for deteksjon av bac-genet tar utgangspunkt i allerede eksisterende protokoller for oppsett av real-time PCR ved seksjon for medisin og FoU ved AMM. Det ble valgt ut stammer som ble ekstrahert ved to ulike metoder; manuell kokelysering og automatisk ekstraksjon på EZ1 Advanced XL. For å validere PCR-metoden ble det utført en temperaturgradientanalyse, undersøkt effektivitet, sensitivitet og spesifisitet. I tillegg ble det utført sekvensering og undersøkelse av sekvenseringsprodukt i programmet «Basic Local Alignment Search Tool» (BLAST). Det ble også satt opp konvensjonell PCR for å sammenligne med real-time PCR-metoden.

I denne oppgaven har det blitt validert en ny metode for påvisning av bac-genet hos GBS ved hjelp av real-time PCR. Metoden har vist seg å være robust med god effektivitet, sensitivitet og spesifisitet. Real-time PCR-metoden kan tas i bruk ved referanselaboratoriet i framtiden og vil kunne avhjelpe bioingeniørene som jobber der.

Streptococcus agalactiae is often referred to as Group B Streptococci (GBS) and is one of the most common causes of infectious disease in newborns. At the National Reference Laboratory for GBS at St. Olavs Hospital, serotypes and subtypes of GBS are monitored. This is to be able to identify any outbreaks and to know which serotypes and subtypes that are present in the population at any given time. The purpose of the bachelor thesis was to establish a real-time PCR-method for detection of the bac-gene in GBS. Today, conventional PCR is used for the detection of the bac-gene, which is time-consuming for the biomedical laboratory scientists working at the Reference Laboratory.

Development of the real-time PCR for detection of the bac-gene is based on already existing protocols for setting up real-time PCR at det section of medicine, research and development. Strains were selected and extracted by two different methods; manual heat lysis and automatic extraction on EZ1 Advanced XL. To validate the PCR-method, a temperature gradient analysis was performed, and efficiency, sensitivity and specificity were examined. In addition, sequencing and examination of the sequencing product in the program “Basic Local Alignment Search Tool” (BLAST) were performed. Conventional PCR was also set up to compare with the real-time PCR-method.

In this thesis, a new method for the detection of the bac-gen in GBS has been validated using real-time PCR. The method has appeared to be robust with good efficiency, sensitivity and specificity. The real-time PCR-method can be used at the Reference Laboratory in the future and will be able to assist the biomedical laboratory scientists who work there.