Phenotypic and Genotypic Characterization of Antimicrobial Resistance in Pseudomonas spp. isolated from the Salmon Industry

Abstract

Antimikrobiell resistens (AMR) utgjør en alvorlig trussel mot verdens folkehelse. For å motarbeide denne trusselen kreves det multisektorale tilnærminger. Én helse-prinsippet er et godt eksempel på en slik tilnærming og kan være avgjørende i kampen mot AMR. Verdikjeden for mat er en viktig sektor som også er involvert i de komplekse utfordringene som AMR utgjør. For å kunne vurdere risikoen for utviklingen og spredningen av AMR i matkjeden kreves det en systematisk resistensovervåkning.

Hovedmålet med denne studien var å karakterisere fenotypisk og genotypisk antimikrobiell resistens hos Pseudomonas spp. isolert fra et norsk prosesseringsanlegg for laks. Dette involverte analyser knyttet til bakteriell resistens mot både antibiotika og desinfeksjonsmidler.

I denne studien ble 33 isolater identifisert ved sekvensering av 16S rRNA, flertallet av isolatene tilhørte Pseudomonas spp. (70%). Polymerasekjedereaksjonen (PCR) ble gjennomført for å påvise syv antimikrobielle resistensgener (qacH, qacEΔ1, bcrABC, sulI, tetG, ampC og floR) blant 162 isolater. Derav 33 isolater som ble identifisert i denne studien og 129 tidligere identifiserte isolater (hovedsakelig Pseudomonas spp.). Svake DNA bånd ble påvist for flere resistensgener, men disse kunne ikke bekreftes ved Sanger-sekvensering. Den bakterielle følsomheten overfor antibiotika ble analysert hos 62 isolater ved bruk av diskdiffusjonsmetoden. Det ble påvist en høy forekomst av ampicillinresistens (79%) og florfenikolresistens (66%), mens ingen av isolatene var resistente mot tetracyklin.

Evnen til biofilmdanelse ble undersøkt hos 38 bakterieisolater ved bruk av in vitro biofilmreaktorer. Totalt 88% av isolatene med høy evne til biofilmdannelse tilhørte Pseudomonas-arter. Videre ble det gjennomført en MBECTM analyse for å kartlegge og sammenligne den antimikrobielle følsomheten av utvalgte isolater i planktonisk tilstand og i biofilmtilstand. I denne analysen ble seks Pseudomonas-isolater og ett L. monocytogenes-isolat testet overfor to desinfeksjonsmidler og ett antibiotikum (florfenicol). Isolatene viste generelt lavere følsomhet overfor de antimikrobielle midlene i biofilmtilstand, sammenlignet med når isolatene var i en planktonisk tilstand. Den anbefalte brukskonsentrasjonen og kontakttiden for desinfeksjonsmidlene viste seg å være effektiv mot isolatene i planktonisk tilstand. Brukskonsentrasjonen og kontakttiden var imidlertid ikke tilstrekkelig for å utrydde isolatene i biofilmtilstand. Den antimikrobielle følsomhetstesten viste også at den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) av florfenikol overfor de utvalgte isolatene varierte mellom 300,00 og > 2400,00 μg/mL florfenikol.

I denne studien belyste vi den høye evnen til biofilmdannelse blant Pseudomonas-arter og effekten av biofilmdannelse på antimikrobiell følsomhet. Den høye forekomsten av fenotypisk ampicillin- og florfenikolresistens kunne ikke forklares med de genotypiske resistensmekanismene som ble undersøkt. Det konkluderes med at det er behov for ytterligere studier for å undersøke forekomsten av bakterier med resistensegenskaper i laksenæringen og for å vurdere risikoen knyttet til AMR spredning gjennom horisontal genoverføring.

Controlling antimicrobial resistance (AMR) and achieving improved public health requires multisectoral approaches like the One Health initiative. The food industry is also involved in the complex challenges imposed by AMR. Continuous AMR monitoring in the food value chain is therefore essential for the assessment of risks to human health.

This study aimed to examine the phenotypic and genotypic antimicrobial resistance of Pseudomonas spp. isolated from a Norwegian salmon processing plant. This included generating baseline data on the prevalence of both disinfectant and antibiotic resistance among these Pseudomonas spp..

We identified 33 isolates by 16S rRNA sequencing and found the majority of the isolates belonging to Pseudomonas spp. (70%). These 33 isolates in addition to 129 previously identified isolates (mostly Pseudomonas spp.) were characterized by polymerase chain reaction (PCR) genotyping for the detection of seven antimicrobial resistance genes (qacH, qacEΔ1, bcrABC, sulI, tetG, ampC and floR). Faint amplicons were detected for several genes, but these could not be confirmed by Sanger sequencing. The antibiotic susceptibility profiles were determined of 62 isolates using the disk diffusion method. A high prevalence of ampicillin resistance (79%) and florfenicol resistance (66%) was found, while none of the isolates were resistant towards tetracycline. In vitro biofilm screening in peg lid reactors, revealed the biofilm formation capabilities among 38 bacterial isolates. A total of 88% of the isolates with high biofilm formation capabilities belonged to Pseudomonas species.

The MBECTM assay was used for high-throughput antimicrobial susceptibility testing of biofilms. Two common disinfectants and one antibiotic (florfenicol) were included in the test. The six Pseudomonas isolates and one L. monocytogenes isolate selected for the test were generally less susceptible towards antimicrobial agents in biofilm state, contra planktonic state. The recommended user concentration and contact time of the disinfectants were effective against isolates in planktonic state. However, the results suggested that the recommended user concentration and contact time was insufficient to eradicate biofilms. The observed minimum inhibitory concentration (MIC) of florfenicol against the selected isolates ranged between 300.00 and >2400.00 μg/mL florfenicol.

In this study we elucidated the high biofilm formation capabilities among Pseudomonas spp. and the subsequent effect of biofilm formation on antimicrobial susceptibility. The high occurrence of the phenotypic ampicillin and florfenicol resistance could not be explained by the genotypic resistance mechanisms that we investigated. Further studies are needed to investigate the prevalence of these resistances in the salmon industry and to assess the risk of dissemination through horizontal gene transfer.