Viability and morphology of human fibroblasts in RGD-functionalized 3D alginate scaffolds Qualitative image analysis with focus on the effects of microstructuring

Abstract

Bruk av tredimensjonal (3D) cellekultivering istedenfor konvensjonell todimensjonal (2D) kultivering er av økende interesse, ettersom det har vist seg å kunne indusere mer komplekse egenskaper og funksjoner hos celler, som ligner mer på de i kroppen eller vev (in vivo). Dette kan bidra til responser av høyere biologisk relevans i cellestudier, og derfor er bruken av dette økende innen cellebiologi, legemiddelutvikling, kreftforskning og vevsteknikk. Mange ulike systemer for 3D-cellekultivering finnes, eksempelvis geler, mikrokapsler eller perler, makroporøse svamper og skum, fibre og andre 3D-matrikser. Hydrogeler, basert på enten syntetiske eller naturlige polymerer, er et attraktivt materiale på grunn av likheter med den ekstracellulære matriksen som finnes rundt celler i vev. Hydrogeler baser på alginat er populære på grunn av høy biokompatibilitet og god evne til å danne geler med varierende mekaniske egenskaper. Alginatgeler lages ofte ved tverrbinding med et divalent kation, som for eksempel Ca2+. Hydrogeler av umodifisert alginat er mindre anvendelige i cellekultur, men kjemisk modifikasjon kan gjøre materialet bioaktivt. Mekaniske egenskaper slik som stivhet, porøsitet og strukturering er også av betydning. For forankringsavhengige celler slik som fibroblaster er ligander som tillater forankring essensielt. Slike celler interagerer med omgivelsene ved å binde til RGD-peptider, enten til fibronektin i den ekstracellulære matriksen in vivo eller til cellekulturmaterialer modifisert med RGD. Binding tillater cellene å utøve kraft mot materialet, noe som tillater bevegelse og spredning av cellen ved polymerisering av aktin filamenter og kontraksjon utøvd av aktin og myosin i cellen. Fibroblaster finnes i kroppens bindevev, og er mye brukt i forskning. I denne studien undersøkes effektene av alginat-mikrostrukturer i 3D-kultivering på levedyktighet og morfologi hos menneskelige fibroblaster. Cellene som ble studert var primærceller fra dermis (NHDF), og cellelinjene IMR-90 og HS-5, henholdsvis med opphav i lungeceller fra embryo og stromale beinmargceller. Cellene ble dyrket opptil 21 dager i et porøst alginatskum og i en homogen gel, begge bestående av 1% Ca2+alginat (75% funksjonalisert med RGD-inneholdende peptid GRGDSP), og analysert etter 1, 7 og 21 dager med bruk av lysmikroskopi, fluorescensfarging og konfokal laserskannemikroskopi, og test av cytotoksisitet baser på frigjort LDH. Ingen store forskjeller i levedyktighet og cytotoksisitet mellom skum og hydrogel ble observert i noen av celletypene. NHDF-cellene var generelt mer levedyktige enn de andre cellene, og interagerte mer med materialet, som muligens kan være relatert til at de er primærceller. Effekter på cellemorfologi ble observert i form av forlengelser av aktin, som i skum var preget av mer organisert cytoskjelett. Over tid foretrakk IMR-90 og HS-5 celle-celle-interaksjon, som kan skyldes inkompatibilitet med materialegenskapene.

The use of three-dimensional (3D) cell culture rather than conventional two-dimensional (2D) cultures is of increasing interest, as it has shown to induce cell characteristics and functions of higher complexity that are more similar to those in vivo. This could offer more biologically relevant responses in cell studies, and therefore it is being actively adopted by fields such as cell biology, drug development, cancer research and tissue engineering. Many different 3D scaffolds exist, such as bulk gels, beads, macroporous sponges and foams, fibers and matrices. Hydrogels, based on synthetic or natural polymers, is considered an attractive material due to their similarity to the extracellular matrix surrounding cells. Alginate hydrogels are one such material, popularly used due to its high biocompatibility and extensive ability to form gels of varying mechanical properties. Alginate gels are most typically formed via crosslinking with a divalent cation such as Ca2+. Unmodified alginate hydrogels typically do not support cell culture. To overcome this, chemical modifications can be applied to render this material as bioactive. However, mechanical properties such as stiffness, porosity and structuring are also of importance. For adherent cells such as fibroblasts, ligands for adhesion are crucial. These cells interact with their surroundings by binding to RGD-peptides, either in vivo to fibronectin of the extracellular matrix or in vitro to RGD grafted onto the culturing material. Attachment allows them to exert force on the material, and thereby also to exhibit movement and spreading by actin filament polymerization and myosin-actin contractility. Fibroblasts are common cells in research and are present in connective tissues throughout the whole body. In this study, the effects of alginate microstructures in 3D scaffolds on the viability and morphology of human fibroblastic cell types were investigated. These cells were primary normal dermal fibroblasts (NHDFs), cell line fetal lung cells (IMR-90) and cell line adult bone marrow cells (HS-5). The cells were cultivated for up to 21 days in a porous alginate foam and a homogeneous gel, both containing 1% (w/v) Ca2+alginate (75% functionalized with RGD-containing peptide GRGDSP), and analyzed after 1, 7 and 21 days using light microscopy, fluorescent labeling and confocal laser scanning microscopy and cytotoxicity tests based on LDH-release. No major differences in viability and cytotoxicity between foam and hydrogel were observed for any of the cell types. The NHDFs were generally more viable than the other cell types, and interacted more with the material, which could be related to them being primary cells. Morphological effects were seen in the form of actin extensions, with more organized cytoskeleton in cells exposed to the foam. Over time IMR-90 and HS-5 seemed to prefer cell-cell interaction, possibly due to inherent incompatibilities with the material properties.