Functional Impact of the Ubiquitin Proteasomal System in Neurodevelopment and Neuroprotection

Abstract

Ubiquitin er et lite molekyl som regulerer en mengde vitale molekylære prosesser i cellene våre ved å binde seg til diverse målproteiner. Ubiquitinaser kan fjerne dette molekylet fra substrat. Blant 100 ubiquitinaser som er identifisert i mennesket, finnes UCHL1. Selv om dette proteinet er svært rikelig i hjernen, er dets nøyaktige funksjon ikke kjent. I 2016, beskrev Rydning et al (1) et norsk enegget tvillingpar med UCHL1-mutasjoner med alvorlig nedsatt motorisk funksjon. I denne studien vil vi undersøke effekten av UCHL1-dysfunksjon i nevrologisk utvikling og beskyttelse via endringer i det viktigste nedbrytningssystemet for proteiner, UPS. Ved å benytte iPS celler reprogrammert fra somatiske celler fra de nevnte UCHL1-pasientene, er målet å generere et monolag av NPC og FB; så vel som hjerneorganoider som menneskelige modeller for å rekapitulere nevrologisk utvikling og patologiske trekk knyttet til UCHL1-dysfunksjon. Generering av iPS celler og NPCer viste seg å være vellykket, samt generering av hjerneorganoider fra de friske kontrollcellene. Utfordringer med NPC-kultivering hindret videre differensiering til FB. Flere forsøk ble gjort, inkludert utprøvelse av ulike protokoller og kloner, uten å lykkes. Det ble uansett utført levedyktighetsanalyser på NPC i respons mot proteasom-hemmere. Basert på responsen fra kontroll-cellene, ble det bestemt passende doser og inkubasjonstidspunkt for videre analyser av kontroll og pasient-celler i respons mot proteasom-hemming. Videre avslørte enzym-aktivitetsanalyser at det ikke var noen forskjell i proteasom 20S aktivitet mellom pasient og kontroll iPS celler. På grunn av forstyrrende signal i kultiveringsmediumet til NPC ble ikke proteasomaktivitet i NPC bestemt. For å sammenligne den globale proteinprofilen av UCHL1-pasientceller med friske kontrollceller ble det utført en kvantitativ masse-spektrometrisk analyse på iPS celler og NPCer. Merkbart hadde LAT2 en to ganger økning i pasient iPS cellene. Dette proteinet har vist seg å være involvert i netthinnens fototransduksjon og er assosiert med forbedret kognitive evner. I pasient-NPC avslørte den proteomiske analysen en nedregulering av UCHL1 proteinet sammenlignet med de friske kontroll NPCene, noe som også er rapportert i pasientens fibroblaster. CHP1, assosiert med ataksi, og nervecelle-markøren DcX var også nedregulert i pasient-derivert NPC. NFM var oppregulert i pasient-NPCene, som er en utpekt markør for nevrodegenerative sykdommer. Det vil være verdifullt å undersøke proteinprofilene til modne nevroner og å verifisere om nivået av de nevnte proteinene endres ytterligere, og samtidig identifisere nye proteiner assosiert med de kliniske egenskapene til UCHL1-pasientene. Det kan ikke utelukkes at UCHL1-mutasjonene har bidratt til manglende suksess ved generering av hjerneorganoider på pasient-cellene, men utvikling av mer robuste og pålitelige protokoller for generering av organoider og differensiering til NPCer er nødvendig for videre investigering av potensielle endringer i UPS, assosiert med UCHL1-dysfunksjon i modne nevroner og hjernemodeller. Samtidig kan protokoller med direkte differensiering fra iPS celler til nevroner stille som et alternativ.

Ubiquitin is a small molecule that regulates a plethora of vital molecular processes in our cells via binding to protein targets. It can be removed from substrates by ubiquitinases. Among a 100 ubiqutinases identified in humans, there is the Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1 (UCHL1) enzyme. Although UCHL1 is highly abundant in the brain, its precise functions remain unknown. In 2016, Rydning et al. (1) described a Norwegian monozygotic twin pair with UCHL1 mutations suffering from severe motor function impairment. In this study, we aim at investigating the impact of UCHL1 dysfunction in neurodevelopment and neuroprotection via alterations on the major protein degradation system regulated by ubiquitin, namely, the Ubiquitin Proteasomal System (UPS). By using induced pluripotent stem cells (iPSC) reprogramed from cells derived from the described UCHL1- patients, we aimed at generating monolayer neuronal cells: Neural Progenitor Cells (NPC) and Mature Forebrain Neurons (FB); as well as brain organoids as human models to recapitulate neurodevelopment and pathological features related to UCHL1 dysfunction. Our data shows that iPSC and NPCs were successful generated, as well as brain organoids from healthy controls. Challenges in culturing NPCs hindered further differentiation to FB. Several attempts including different protocols and clones were performed without success. Nevertheless, viability assays were performed with NPCs using proteasome inhibitors. Based on the response of control NPCs, suitable doses as well as appropriated incubation time points were determined for further investigations of responses of control and patient-derived NPC upon proteasome inhibition. Moreover, proteasome 20S activity assays revealed no differences in basal level proteasomal activities between control and patient-derived cells in iPSC. Due to interfering signals in culture media, proteasomal activities in NPC were not determined. Alternative culturing conditions were identified to overcome this issue. Furthermore, quantitative mass spectrometry analysis was employed for the comparison of global protein expression profiles of healthy control- and patient-derived cells at two distinct developmental stages: iPSC and NPC. Notably, a 2-fold increase in the large amino transporter 2 (LAT2) was detected in patient iPSC. LAT2 has shown to be involved in retinal phototransduction and enhanced cognition. In UCHL1-patient NPCs, the proteomics data revealed downregulation of UCHL1, also reported in UCHL1-patient’s fibroblasts; Calcineurin B homologous protein 1 (CHP1), which is associated with ataxia; and the neuronal marker Doublecortin (DcX). Up-regulation of Neurofilament medium polypeptide (NFM), a suggested marker of neurodegenerative diseases was also detected in UCHL1-deficient NPCs. It would be quite valuable to investigate the protein profiles of mature neurons and verify whether the levels of the mentioned proteins would be further altered, along with identification of novel protein targets associated with the clinical features of the disease. We cannot rule out that the UCHL1 mutations may be a major contributor for the lack of success in growing patient-derived brain organoid. However, development of more robust and reliable protocols for the generation of organoids, as well as NPCs, are necessary for further investigation of potential alterations in UPS associated to UCHL1 dysfunction in mature neurons and 3D brain models. Moreover, protocols that is based on direct differentiation of iPSCs to neurons could also serve as an alternative approach to obtain mature neurons.