Monte Carlo Simulation and in vitro Studies on the Effects of Polysaccharide Conjugation on Enzyme Immobilization

Abstract

I dette arbeidet ble adsorberingsevnen til konjugater av lysozym og dekstransulfat, produsert ved hjelp av Maillardreaksjonen, undersøkt. I tillegg undersøkte man grad av konjugering og enzymaktiviteten til kompleksene. Arbeidet var ment som et konseptbevis; konjugering av ladde karbohydrater til enzymer øker enzymimmobiliseringen, uten å endre deres primære funksjon, nemlig enzymaktiviteten. Dette kan anvendes for å øke enzymimmobilisering for bruk i biokatalytiske applikasjoner.

Det ble undersøkt hvilken inkubasjonstid som ga høyest mulig grad av konjugering i prøvene. En fluorescamine test ble brukt for å bestemme mengden tilgjengelige primæraminer på lysozymet. Denne bekreftet at konjugeringen i prøvene var vellykket, men at graden av konjugering ikke hadde noen sammenheng med de valgte inkubasjonstidene. SDS-PAGE ble brukt til å bestemme molekylvekten til prøvene, men dette ga ingen indikasjon på vellykket konjugering. DLS-målingene viste ingen klare bevis på økning i den hydrodynamiske størrelsen til prøvene. Videre ble det funnet at enzymaktiviteten til lysozymet i prøvene ikke ble hemmet, sammenlignet med naturlig lysozym. I tillegg så man at adsorberingsevnen til lysozym-dekstransulfatkonjugatene økte sammenlignet med deres respektive lysozymkontroller. Økningen i adsorberingsevnen skyldes primært en økning i elektrostatisk tiltrekning mellom de ladde overflatene og polyelektrolytthalene. Resultatene fra in vitro-studiene og Monte Carlo-simuleringene var samstemte.

Denne oppgaven fungerer som et konseptbevis; adsorberingsegenskapene til lysozym- dekstransulfatkonjugatene, produsert ved hjelp av Maillardreaksjonen, økte sammenlignet med naturlig lysozym uten å hemme enzymaktiviteten til lysozymet.

The aim of this work was to improve enzyme immobilization while keeping its activity. For this purpose, the lysozyme and dextran sulfate were conjugated through the Maillard reaction. This work was intended as a proof of concept that conjugating charged carbohydrates to enzymes increases the immobilization of the enzymes for use in biocatalytic applications, without significantly altering their primary function, namely their enzymatic activity.

The incubation time during the reaction was varied, in order to find the optimal reaction conditions which would result in the largest degree of conjugation in the samples. Using a fluorescamine assay for primary amine determination, the samples were found to have had successful conjugation. No clear trend of the degree of conjugation was found for the selected incubation times. SDS-PAGE was also used to determine the molecular weight of the samples, though this gave no indication of successful conjugation in the samples. DLS measurements did not give any conclusive evidence of increased hydrodynamic size due to successful conjugation either. Furthermore, the enzymatic activity of the lysozyme in the samples was found to not be inhibited by the conjugation process, when compared to native lysozyme. Lastly, the adsorption properties were found to increase for the lysozyme-dextran sulfate conjugates when compared to their respective lysozyme control samples. The increase in adsorption was found to be primarily due to an increase in the electrostatic attractions between the charged surfaces and the polyelectrolyte tails. The results of the in vitro studies aligned well with the results from the Monte Carlo simulations.

This thesis confirmed the proof of concept it was set to establish; the adsorption properties of conjugates of lysozyme and dextran sulfate, produced through the Maillard reaction, were increased in comparison to native lysozyme, without inhibiting the enzymatic activity of the lysozyme.