| dc.description.abstract | Hjertet er av avgjørende betydning for menneskers helse og livskvalitet og forstyrrelser av dets funksjon kan ha livstruende konsekvenser. Ettersom dyremodeller ikke er i stand til å fullstendig representere detaljene i menneskelig hjertebiologi, kreves andre modellsystemer for å studere organet in vitro. Humane pluripotente stamceller (iPSCer) er et utmerket utgangsmaterial for å generere slike hjertemodeller, da de kan differensieres til nærsagt alle celletyper, inklusivt hjerteceller. I tillegg kan pasientspesifikke iPSCer enkelt produseres fra pasientprøver anskaffet på ikke-invasive metoder. Av spesiell interesse er iPSC-deriverte tredimensjonale hjertestrukturer, kjent som hjerteorganoider, som har unike egenskaper i å etterligne hjertevevet in vivo. Slike hjerteorganoider kan være av stor betydning for å studere hjertets embryonale utvikling, undersøke hjertesykdommer, generering av nytt hjertevev til transplantasjon, samt identifisere nye legemidler og teste legemidlers kardiotoksikologi. I Norge har det så langt vært begrenset forskning på hjerteorganoider. Denne oppgaven har derfor som mål å etablere en robust og pålitelig protokoll for generering av hjerteorganoider fra iPSCer. For å oppnå dette målet har to metoder blitt undersøkt: Den første metoden benytter en indirekte tilnærming hvor kardiogen differensiering innledningsvis utføres i monolagkultur. De oppnådde hjertecellene dissosieres og blir deretter brukt til å danne organoider i mikrobrønner. Den andre metoden er en direkte differensiering av iPSCer som embroidlegemer i suspensjonskultur til hjerteorganoider. Begge metodene er basert på en tidligere produsert protokoll som bruker sekvensiell modulering av WNT-signalveien for å veilede iPSCer inn i en kardiogen skjebne. Hjertecellene ble vurdert ved visuelle undersøkelser, immunocytokjemi, qPCR og mikroelektrodearray. Både den indirekte og direkte differensieringen ga funksjonelle hjerteorganoider med rytmiske, spontane kontraksjoner og med en høy andel kardiomyoytter og færre hjertefibroblaster. Smalet sett ble de beste organoidene oppnådd ved bruk av den direkte metoden som ga større organoider med høyere grad av intern organisering. Undersøkelser av endringer i genekspresjon i løpet av differensiering viste tydelige likheter til kardiogenesen in vivo. Det ble imidlertid observert store variasjoner mellom ulike iPSC-kloner og eksperimenter noe som indikerer at mer optimalisering er nødvendig. Å undersøke hvorfor disse variasjonene oppstår kan også ha stor verdi for å øke differensieringens suksessgrad. I tillegg vil ytterligere økt celletypekompleksiteten i hjerteorganoider forbedre deres evne til å mimikere humant hjertevev. I løpet av dette studiet ble også hudbiopsier fra pasienter med genetiske mutasjoner som påvirker hjertefunksjonen brukt til å produsere fibroblaster, som videre ble reprogrammert til iPSCer til bruk i fremtidig forskning. | |
| dc.description.abstract | The heart is vital for human health and life quality, and perturbations of its functions may have detrimental impacts. As animal models cannot represent the high complexity of the human heart biology, other models are needed to study this organ in vitro. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be an excellent option for generating such heart models as they are able to differentiate into virtually any cell type, including cardiac cells. In addition, patient-specific iPSCs can be easily produced from patient samples obtained by non-invasive methods. Of special interest, is the formation of three-dimensional heart structures, known as cardiac organoids, which can mimic biological features of the heart tissue in vivo displaying a high degree of complexity, cell-cell-interactions and cell organization. Cardiac organoids may be of great value to study heart development, investigate heart diseases, as models in regenerative therapy, and to identify novel drugs and test drug cardiotoxicology. In Norway there is still limited research on cardiac organoids, and thereby this thesis was dedicated to establishing a robust and reliable protocol for the generation of cardiac organoids from iPSC. To achieve this goal, two approaches have been investigated: in the first, cardiac organoids were produced through an indirect approach, with an initial cardiogenic differentiation of iPSC in monolayer. The obtained cardiac cells were subsequently dissociated and used to form organoids in tiny microwells; the second approach is a direct differentiation of iPSCs as embryoid bodies in suspension culture to cardiac organoids. Both approaches are based on a previously published protocol which uses temporal modulation of the WNT signalling pathway to guide iPSCs into a cardiac cell fate. The cardiac cells were assessed by visual examination, immunocytochemistry, qPCR, and with microelectrode array. Both approaches yielded functional cardiac organoids with rhymical spontaneous contractions and high percentage of cardiomyocytes and fewer cardiac fibroblasts. Overall, the best organoids were achieved using the direct approach which yielded larger sizes and more internal organization. Gene expression data during differentiation revealed similarities to what is observed in cardiogenesis in vivo. However, clonal and batch variations were evident indicating that more optimalization is needed. Investigating into why these variations occur may also be of great value in increasing differentiation success rate. Moreover, further increasing the cell type complexity of the cardiac organoids will enhance their resemblance of the human heart. Finally, in addition to exploring cardiogenic differentiation protocols, skin biopsies from patient with genetic mutations affecting heart function were used to produce fibroblasts, which were further successfully reprogrammed into iPSCs for use in future research. | |