| dc.description.abstract | Nyere forskning har hatt et skifte i fokus fra utnyttelse av syntetiske polymerer til utnyttelse av biopolymerer. Produksjon av blokk polysakkarider er et relativt nytt felt med høyt potensial grunnet allsidigheten og mangfoldet av polysakkarider. Arbeidet til denne masteroppgaven fokuserte på kitin og utfordringene rundt løseligheten til dette polysakkaridet grunnet interessen i dets egenskaper, som dets immunogene aktivitet for utvikling av nye medisinske behandlinger. Annet arbeid inkluderte optimalisering av allerede etablerte protokoller.
Fullt N-acetylerte vannløselige og vann uløselige kitin oligosakkarider av typen AnM ble produsert ved degradering av kitosan med et overskudd av salpetersyrling. Dextran oligosakkarid konjugater (dextran-PDHA) ble produsert ved syrehydrolyse av høymolekylær dextran, og konjugert til PDHA ved reduktiv aminering. Reaksjonsblandingene ble fraksjonert med størrelseseksklusjons-kromatografi (SEC) og karakterisert med proton kjernemagnetisk resonans spektroskopi (1H-NMR) og SEC med multivinkel laser lysspredning (SEC-MALLS).
Hovedfokuset til denne oppgaven var rettet mot de vann-uløselige AnM oligosakkaridene, da det er begrenset med forskning på disse grunnet utfordringene rundt løselighet. Først ble degradering av kitosan kombinert med konjugering til PDHA. Antakelsen var at ved konjugering til PDHA ville en terminal ladning bli introdusert, som muligens kunne hindre de lengre oligosakkaridene fra den initielle utfellingen. Reaksjonen var ikke vellykket da sluttproduktet var kitosan uten bevis på konjugering.
Alternative løsemidler ble testet, hvor N,N-dimethylacetamide (DMAc) med noen prosent LiCl viste seg å være et passende system. Preliminære studier viste suksessfull konjugering av vannløselig AnM til AnM-PDHA i 8wt% LiCl/DMAc. Videre ble vann-uløselig AnM vellykket konjugert til dextran-PDHA. Dextran ble valgt som den andre blokken basert på hypotesen om at konjugering til et stoff med høy løselighet ville øke løseligheten til det ferdige konjugatet, som viste seg å stemme. 1H-NMR og SEC-MALLS analyser bekreftet konjugeringen.
1H-NMR med deuterert DMAc som løsemiddel ble testet for å kunne utføre studier av reaksjonskinetikken til konjugeringen i LiCl/DMAc. Omfattende forsøk ga ingen tydelige resultat. Metoden for resten av arbeidet for denne masteroppgaven ble derfor å rense prøven og løse den i D2O for 1H-NMR analyser.
Reaksjonskinetikk utført uten real time NMR viste at konjugeringen i DMAc skjer raskt, med likevekts utbytte på henholdsvis 60% og 40% for vannløselig og vann-uløselig AnM, oppnådd innen 15 minutter. I tillegg kan likevekts utbyttet økes til 84% ved å bruke et overskudd av kitin.
De kinetiske parameterne for reduktiv aminering av vannløselig AnM til dextran-PDHA ved standardbetingelser ble bestemt. Reaksjonshastighetskonstantene viste at ved bruk av kitin som den andre blokken så var reaksjonen en størrelsesorden raskere enn ved bruk av dextran som den andre blokken. Derimot var reduksjonen tidkrevende i begge tilfeller.
Som et sideprosjekt ble det forsøkt å bestemme reaksjonskinetikken av perjodatoksidering av kitin basert på målinger av optisk rotasjon. Perjodatoksidering angriper selektivt de vicinale diolene på den ikke-reduserende enden av kitin og produserer et dialdehyd. Dette ble tenkt å endre rotasjonen av molekylet. Ingen endring i optisk rotasjon ble målt, det ble dermed konkludert at måling av optisk rotasjon er ikke en passende metode for å bestemme graden av perjodatoksidering av kitin.
Utvikling av en protokoll for konjugering av vann-uløselig kitin til dextran som gir et vannløselig konjugat, kan være grunnlaget for videre forskning på vann-uløselig kitin og relatert bioaktivitet. | |
| dc.description.abstract | Recent research has had a shift in focus from exploitation of synthetic polymers to exploitation of biopolymers. Creating block polysaccharides is a relatively new field of research which has great potential due to the versatility and abundance of polysaccharides. The work in this thesis focused on chitin and the challenges regarding the solubility due to its interesting properties, such as its immunogenic activity for development of novel therapies. Additional work included optimization of already established protocols.
Fully N-acetylated water-soluble and water insoluble chitin oligosaccharides of the type AnM were produced by degradation of chitosan with an excess of nitrous acid. Dextran oligosaccharide conjugates (dextran-PDHA) were obtained by hydrochloric acid hydrolysis of high molecular weight dextran and conjugated to PDHA by reductive amination. The mixtures were fractioned by size exclusion chromatography (SEC) and characterized by proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) and SEC with multi-angle laser light scattering (SEC-MALLS).
The main focus of this thesis was directed towards the water insoluble AnM oligosaccharides, as research is limited due to the solubility challenges. First, simultaneous nitrous acid degradation of chitosan and conjugation to PDHA was attempted. The assumption was that by conjugating to PDHA, a terminal charge would be introduced, possibly preventing the longer oligosaccharides from the initial precipitation. The reaction was not successful as it generated chitosan with no evidence of conjugation.
Alternative solvents were tested, whereas N,N-dimethylacetamide (DMAc) with a few percent of LiCl proved as a viable solvent system. A preliminary study showed successful conjugation of water-soluble AnM to AnM-PDHA in 8wt% LiCl/DMAc. Furthermore, water insoluble AnM was successfully conjugated to dextran-PDHA. Dextran was chosen as the second block due to the hypothesis that conjugation to a compound of high solubility would keep the finished conjugate water-soluble, which indeed it did. 1H-NMR and SEC-MALLS analyses confirmed successful conjugation.
1H-NMR using deuterated DMAc was attempted to allow for studies of the reaction kinetics of the conjugation in LiCl/DMAc. Comprehensive studies gave inconclusive results, which meant that the method of choice had to be purification of the reaction mixture and redissolve it in D2O for 1H-NMR analyses.
Reaction kinetics analyses performed aside from 1H-NMR showed that the conjugation in DMAc happens at a fast rate, with equilibrium yields of roughly 60% and 40% for water-soluble and water insoluble AnM (respectively) obtained within 15 minutes. Additionally, using an excess of chitin resulted in an equilibrium yield of 84%.
Additionally, the kinetic parameters for the reductive amination of water-soluble AnM to dextran-PDHA in standard conditions were established. When using chitin as the second block, the reaction was one order of magnitude faster than with dextran as the second block. However, the reduction was time consuming in both cases.
As a side project, the kinetics of the periodate oxidation of chitin was attempted elucidated by optical rotation measurements. Periodate oxidation selectively targets the vicinal diol of the non-reducing end, creating a dialdehyde, possibly changing the rotation of the molecule. Nonetheless, no change in the optical rotation was detected, hence this method is not appropriate to determine the degree of periodate oxidation of chitin.
The development of a protocol for conjugation of water insoluble chitin to dextran to produce a water-soluble conjugate, serves as a basis for further research on the water insoluble fraction and related bioactivity. | |
