Optimized Miniature Two-Photon Microscopy for Imaging Neuronal Activity in Freely Moving Mice

Abstract

Oppfinnelsen av nye avbildningsteknikker har alltid banet vei for påfølgende gjennombrudd i biovitenskapen og det såkalte to-foton mikroskopet er intet unntak. Teknikken muliggjør rask, kalsiumbasert avbildning av nevron-populasjoner langt inne i hjernen til gnagere. Likevel har studier som krever fri adferd og bevegelse i rommet lenge vært utenfor rekkevidde, da mikroskopet typisk er veldig stort og dyret derfor må spennes fast i det. I løpet av de siste årene har derimot miniatyr to-foton mikroskopi dukket opp som en lovende løsning på dette problemet. Likevel er denne teknikken den dag i dag fortsatt begrenset av et relativt lavt utbytte av avbildede nevroner, som følger av et lite synsfelt og en kort Z-skanningslengde.

Målet ved dette masterprosjektet har vært å utvide det oppnåelige synsfeltet og Z-skanningslengden til et tidligere utviklet miniatyr to-foton mikroskop ved å erstatte skannelinsen og øke antallet justerbare linser. Datasimuleringer og teoretiske beregninger ble benyttet for å utvikle det nye mikroskopdesignet, etterfulgt av konstruksjonen av det fysiske instrumentet. Mikroskopets ytelse ble validert eksperimentelt via avbildning av ikke-biologiske, standardiserte prøver og GCaMP6-basert nevronaktivitet over fire plan i den primære visuelle korteksen til en fritt-bevegende mus.

Miniatyrmikroskopet utviklet i dette prosjektet tillater både tredimensjonal avbildning og avbildning over flere plan simultant over et volum på 500 μm × 500 μm × 240 μm. Sammenlignet med sin forgjenger har instrumentet 55% større synsfelt, 3 ganger så lang Z-skanningslengde, og en tilsvarende vekt som det tidligere mikroskopet på 2,54 g. Videre viste forsøkene i dette prosjektet at den gjennomsnittlige laterale oppløsningen er på 1,81 μm, mens den gjennomsnittlige aksiale oppløsningen er på 17,24 μm. Mikroskopet mottar femtosekunds laserpulser på 920 nm via en hulkjernet fotonisk krystallfiber, muliggjør avbildning av vanlige kalsiumindikatorer, og tillater reversibel og stabil hodemontering. Avbildningen av mer enn 1000 nerveceller ble også demonstrert med instrumentet.

Til tross for at miniatyrmikroskopet utviklet i dette prosjektet ville dratt nytte av ytterligere forbedring og optimalisering, gir likevel det utvidede synsfeltet og den lengre Z-skanningslengden et forbedret celleutbytte i sammenlikning med tidligere utviklede miniatyr to-foton mikroskop. Med dens mulighet til å simultant avbilde hundrevis av celler i hjernen til fritt bevegende dyr er dermed mikroskopet et innovativt bidrag til dagens eksisterende verktøykassen av miniatyrmikroskop. De kommende årene vil trolig være preget av ytterligere framskritt innen miniatyrmikroskopi, og teknikken vi kunne gi nevroforskere helt nye verktøy som potensielt kan ta vår kunnskap om nevrale kretser til et fullstendig nytt nivå.

Advances in recording techniques have always paved the way for subsequent breakthroughs in the life sciences, and the two-photon microscope, allowing fast, population-level calcium imaging of neurons deep within the brains of rodents, is no exception. Nonetheless, the necessity of head-fixation has long limited the applications of two-photon microscopes, as the study of many elemental neural processes largely depends on non-stationary behavior. Over the past years, miniature two-photon microscopy has emerged as a promising technique in overcoming this obstacle, but one major drawback remains the relatively low yield of imaged neurons, limited by the microscope’s field of view and Z-scanning range.

The aim of this project was to increase the maximum attainable field of view and Z-scanning range of a previously developed head-mountable miniature two-photon microscope by replacing the scan lens and increasing the number of tunable lenses. Computer-aided design and theoretical calculations aided the creation of the new microscope, and were followed by the assembly of the physical device. The microscope’s performance was validated experimentally on non-biological targets and by in vivo imaging of neuronal activity from GCaMP6 fluorescence across four planes in the primary visual cortex of a freely-moving mouse.

The developed miniature microscope is capable of multi-plane and volumetric imaging over a volume of 500 μm × 500 μm × 240 μm. Compared with its predecessor, the system achieves a 55% larger field of view, has 3 times the Z-scanning range, and possesses approximately the same weight, corresponding to only 2.54 g. Moreover, the miniature microscope’s average resolution was shown to be 1.81 μm laterally and 17.24 μm axially across the imaging volume. The device receives 920 nm femtosecond laser pulses via a hollow-core photonic crystal fiber, facilitates imaging of common calcium sensors and allows reversible and stable head-mounting. Lastly, parallel in vivo imaging of more than 1,000 nerve cells was demonstrated with the developed microscope.

Although the miniature microscope reported here could benefit from further refinement and optimization, its extended field of view and Z-scanning range nonetheless give an advantageous cell yield in comparison to previously developed miniature two-photon microscopy approaches. Thereby, the device serves as an innovative addition to the existing toolbox of open-source head-mountable microscopes, facilitating simultaneous imaging of hundreds of cells from the brains of animals displaying spatially dispersed, exploratory or goal-directed behavior. In total, the development of miniature microscopes will likely only advance in the years to come, providing neuroscientists with novel tools for pushing the boundaries of our knowledge on neural-population algorithms to a whole new level.