| dc.description.abstract | Samspillet mellom DNA-bindende proteiner og DNA er svært viktig i mange cellulære prosesser. Inntil nylig har det vært antatt at proteiners funksjon er direkte avhengig av deres veldefinerte, tredimensjonale struktur. Iboende ustrukturerte regioner mangler disse spesifikasjonene, men det fremkommer stadig flere beviser på deres nødvendige roller i proteiner, da spesielt DNA-bindende proteiner. I denne sammenhengen kan disse regionene bestå av både ustrukturerte haler og fleksible lenker, som er ustrukturerte regioner koblet til henholdsvis ett eller to DNA-bindende domener. De kan påvirke både spesifisiteten og affiniteten til proteinet for DNA, og dermed spille en avgjørende rolle i samspillet mellom dem. Imidlertid er de underliggende molekylære mekanismene til de ustrukturerte regionene ikke fullt ut forstått.
I dette arbeidet ble effekten av totalladning og ladningsfordeling i ustrukturerte regioner på bindingen mellom DNA and DNA-bindende molekyler undersøkt. De DNA-bindende domenene ble etterlignet ved bruk av positivt ladede PAMAM dendrimerer, som binder uspesifikt til negativt ladet DNA. Peptider med forskjellige ladninger og ladningsfordelinger imiterte de ustrukturerte regionene og ble konjugert til dendrimerene. De resulterende strukturene ble analysert ved bruk av massespektrometri, men den nøyaktige molekylstrukturen var ikke mulig å bestemme. Eksperimentene antydet likevel at dendrimerene og peptidene hadde konjugert. Interaksjonene mellom de resulterende konjugatene og DNA ble studert ved bruk av fargestoffekskluderingsanalyser og gelelektroforese. DNA-kondensasjon ble ikke observert for konjugatene med negativt ladede peptider. Dette antyder at peptidene inverterer ladningen til PAMAM, og forhindrer at den blir bundet til DNA ved elektrostatisk frastøting. Konjugater med nøytrale eller tilnærmet nøytrale peptider viste en mye svakere DNA-kondensasjon sammenlignet med ikke-konjugert PAMAM. Resultatene indikerer at konjugatene binder seg til DNA, men de ustrukturerte halene hindrer kondensasjonen til en viss grad. For konjugatene med positivt ladede peptider ble kondensering av DNA enten økt eller holdt konstant, sammenlignet med kondenseringen av ikke-konjugerte dendrimerer. I tillegg ble peptider med forskjellige aminosyredistribusjoner, med samme totale positive ladning, undersøkt. Dessverre var det ikke mulig å trekke signifikante konklusjoner angående effekten av aminosyrearkitektur på bindingen mellom DNA og konjugater. | |
| dc.description.abstract | The interactions between DNA-binding proteins and DNA are highly important in many cellular processes. Until recently, it has been believed that the function of proteins is directly dependent on their well-defined, three-dimensional structure. Intrinsically disordered regions (IDRs) lack these requirements, but there is growing evidence for their importance in proteins, especially DNA-binding proteins. Within this context, IDRs include both disordered tails and flexible linkers, which are disordered regions connected to one or two DNA-binding domains (DBDs), respectively. They can affect both the specificity and affinity of the protein to DNA, and thereby play a crucial role in the interactions between them. However, the underlying molecular mechanisms of IDRs are not fully understood.
In this work, the effect of overall charge and charge distribution in disordered regions on the binding between DNA and DNA-binding molecules was investigated. The DBDs were mimicked using positively charged PAMAM dendrimers, which bind non-specifically to the negatively charged DNA. Peptides of various charge and charge distributions were conjugated to the dendrimers, mimicking IDRs. The resulting structures were assessed by mass spectrometry, but the exact molecule structures were not possible to determine. However, the results strongly suggest that the peptides conjugated to the dendrimers. The interactions between the resulting conjugates and DNA were studied using dye exclusion assays and gel electrophoresis. For the conjugates possessing negatively charged peptides, DNA condensation was not observed. This suggests that the peptides invert the charge of the PAMAM, preventing it from binding to DNA by electrostatic repulsion. Conjugates with neutral or approximately neutral peptides showed a much weaker DNA condensation compared to non-conjugated PAMAM. The results indicate that the conjugates bind to DNA, but the tails hinder condensation to some degree. For the conjugates possessing positively charged peptides, condensation of DNA was either increased or remained constant, compared to condensation by the non-conjugated dendrimers. In addition, peptides with different amino acid distributions, with the same total positive charge, were investigated. Unfortunately, it was not possible to draw significant conclusions regarding the effect of amino acid architecture on the binding between DNA and conjugates. | |
