Spectroscopic Diversity of Fluorescent Amyloid Ligand Interactions with Native Transthyretin
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/2785561Utgivelsesdato
2020Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Institutt for fysikk [2650]
Sammendrag
Proteinet Transthyretin (TTR) er et transportprotein knyttet til en rekke sykdommer kalt amyloidose. Amyloidose er karakterisert ved at avleiringer av proteiner danner skadelige amyloidfibriller som er svært stabile og uløselige. Disse proteinaggregatene, eller avleiringene av TTR, er forbundet til sykdommer som for eksempel en type Alzheimers sykdom, karpaltunnelsyndrom og hjertesykdom. Karakterisering av TTR-proteinet er derfor viktig for å få en bedre kunnskap om selve proteinet, samt bruke dette videre for å kunne diagnostisere TTR-relaterte sykdommer i en tidlig fase. Dermed vil det være mulig å gi nødvendige behandlinger så tidlig som mulig.
Fluorescerende molekyler, eller prober, sammen med fotofysiske prosesser har vist seg å være en god metode for karakterisering av amyloidstrukturer ved å markere, eller farge, proteinaggregatene. Probene p-FTAA, hx-FTAA, h-FTAA, Py1SA, Py2SA, X-34, BTD-SB, HS-169 og ANS, har vist seg å være nye og interessante amyloidbindende molekyler som ble i denne avhandlingen brukt til å markere TTR-proteinet. Alle disse probene har gitt resultater som kan være med på å karakterisere proteinstrukturen.
Det ble gjennomført absorpsjonsspektroskopi av de fluorescerende probene og TTR-proteinet for å bestemme områdene hvor de forskjellige stoffene eksiterer. Fluorescensspektroskopi ble deretter benyttet for å se på spektrale skift, forskjeller og sammenligninger mellom probene både med og uten TTR-proteinet. Målinger av kvantegrad og levetider ble så utført for å ytterligere karakterisere de fotofysiske prosessene og parametrene til TTR, og potensielle prober. Videre ble FRET brukt for å få et kvalitativt mål på avstanden mellom diverse prober og tryptofanene i TTR-proteinet. Ved å bruke anisotropi, var det mulig å beregne rotasjonsdiffusjonstiden til TTR ved bruk av prober med lang levetid.
Blant de fluorescerende probene, var det h-FTAA, X-34 og HS-169 i PBS som viste de største spektrale skiftene når de ble bundet til TTR, der emisjonsspektrene ble vesentlig blå-skiftet. Resten av probene viste også tendensen til et blå-skiftet spekter når de ble bundet til TTR. I tillegg viste Py2SA noen interessante forandringer og avvik i sitt emisjonsspekter.
For målingene angående kvanteeffekten og kvantegraden, ser vi en økende tendens når probene blir bundet til TTR. Her er X-34 definitivt den mest interessante kandidaten, da den får en økning fra 4,7% til 44,3%. For målinger når det gjelder levetid av molekylene, ser vi også en økende trend når TTR tilsettes. Proben med lengst levetid er Py2SA med en eksitert levetid på 7.1 ns, og 31.2 ns når den er bundet til TTR. På grunn av lang levetid, ble denne proben brukt til beregninger av rotasjonsdynamikken til TTR. Rotasjonskorrelasjonstiden for Py2SA bundet til TTR ble beregnet til å være 19 ns. Anisotropiberegningene, sammen med FRET-resultater og molekylær dokking, viser at det faktisk er en interaksjon mellom probene og proteinet. Siden alle probene viser optiske egenskaper med TTR, kan de brukes til karakterisering, og potensielt verktøy til diagnosering av nevrodegenerative sykdommer knyttet til TTR. The protein Transthyretin (TTR) is a transport protein linked to a group of diseases called amyloidosis. Amyloidosis is characterized by protein misfolding forming toxic amyloid fibrils which are highly stable and insoluble. These protein aggregates, or depositions of TTR, are the root of diseases such as a variant of Alzheimer's disease, Carpal Tunnel Syndrome and heart failures. Characterization of the TTR protein is therefore important for better knowledge of the protein itself, and to further use this to be able to diagnose the TTR related diseases at an early stage. By this it is possible to give necessary treatments as early as possible.
Fluorescent binding probes or molecules together with photo-physical processes have shown to be a powerful method of characterization of amyloid structure by staining the protein aggregates. The probes p-FTAA, hx-FTAA, h-FTAA, Py1SA, Py2SA, X-34, BTD-SB, HS-169 and ANS, have shown to be novel amyloid binding probes used to stain the TTR protein under inspection. These probes all have the feature of characterizing the protein structure in terms of fluorescence spectra.
Absorption spectroscopy of the fluorescent binding probes and the TTR protein was performed to determine the wavelength regions accessible for excitation. Fluorescence spectroscopy was then utilized to look at spectral shifts, differences and comparisons of the probes, with and without TTR protein. Quantum efficiency and lifetime measurements were then carried out to further characterize the photo-physical processes and parameters of TTR and potential probes. Furthermore, the FRET effect was used to obtain a qualitative measure of the distance between the fluorescent probes and tryptophans in the TTR protein. From the time-resolved anisotropy it was possible to calculate the rotational diffusion time using probes with long lifetime.
Among the fluorescent probes, h-FTAA, X-34 and HS-169 in PBS showed the largest spectral shift when they are bound to TTR, where the emission spectra are substantially blue-shifted. The rest of the probes also show the trend of blue-shifting when binding to TTR. Py2SA is also showing interesting discrepancies in its emission spectrum.
Quantum efficiency measurements show an increasing trend when the probes are bound to TTR, with X-34 being the most interesting candidate with an increase from 4.7% to 44.3%. Also for lifetime measurements the probes show a general increase of in excited state lifetime when TTR is added. The probe with the longest lifetime is Py2SA with an excited state lifetime of 7.1 ns, and 31.2 ns when bound to TTR. Because of its long lifetime, it was used for calculations of the rotational dynamics of TTR. The rotational correlation time of Py2SA bound to TTR was calculated to be 19 ns. The anisotropy calculations, together with FRET results and molecular docking, show indeed that there is an interaction between the probes and the protein. With all the probes showing optical properties with TTR, they all can be used in characterization, and potentially for diagnosis tools for neurodegenerative diseases linked to TTR.