Effects of Ultrasound-Stimulated Microbubble Treatment on Blood Perfusion and Vascular Permeability in Tumors

Abstract

Ultralyd, i kombinasjon med mikrobobler (MB), har fremstått som en lovende metode for å forbedre levering av medikamentbelastede nanopartikler til svulstvev. Til tross for enorm fremgang i produksjon av nanopartikler, er akkumulering av nanopartikler og medikamenter i svulster fortsatt utilstrekkelig. I tillegg har ultralydstimulerte MB også blitt rapportert å påvirke perfusjon i svulster. Målet med dette studiet er å undersøke effektene av ultralydstimulerte MB på blod perfusjon og vaskulær permeabilitet i subkutane svulster i mus. Undersøkelsen ble utført ved å bruke to bildemodaliteter: fotoakustisk avbildning og konfokal laserskanningsmikroskopi. OHS-svulster ble dyrket i bakbenet til BALB/c nakne mus (n=10), tilfeldig delt inn i tre grupper: kontroll ubehandlet (n=3), kontroll MBs (n=2), og behandlet ultralydstimulerte MB (n=5) grupper. For behandlet ultralydstimulerte MB og kontroll MB grupper, ble en bolus SonoVue MB injisert intravenøst. For behandlet ultralydstimulert MB gruppe ble injeksjonen fulgt av ultralydeksponering. Prosedyren ble gjentatt med en ny bolusinjeksjon av SonoVue for behandlet ultralydstimulerte MB, og kontroll MB dyr, og annen ultralydeksponering for behandlet ultralydstimulert MB dyr. Kontroll ubehandlet gruppe fikk ingen behandling. Fotoakustisk avbildning ble utført ved fem forskjellige tidspunkter, med behandling gitt mellom første og andre tidspunkter. Fluorescein-merket lektin ble injisert intravenøst for å merke funksjonelle blodårer før dyrene var avlivet og svulster skåret ut. Frosset i flytende nitrogen svulster ble kuttet opp i 30 seksjoner hver, delt inn i seks dybdenivåer. Svulstseksjoner ble hver for seg farget med antistoff for CD31 (blodårer) og CD144 (endoteliale intercellulære forbindelser). Hele seksjoner, farget for CD31, ble avbildet med konfokal laserskanningsmikroskopi som utførte tile skanning, mens flere øyeblikksbilder av forskjellige blodårer i seksjoner, farget for CD144, ble ervervet. Tile skannede-bilder ble analysert i ImageJ, og antall funksjonelle blodårer og totalt antall blodårer var sammenlignet. Øyeblikksbilder med CD144 ble også analysert i ImageJ, og antall CD144 piksler ble sammenlignet med lektin piksler. Fotoakustisk 3D skanninger var analysert i Vevo LAB, og oksygenmetning og hemoglobinverdier ble utvunnet. Gjennomsnittlig oksygenmetning ga ingen signifikant forskjell mellom grupper, og ble sterkt påvirket av isoflurananastesi. 15 min etter behandling var gjennomsnittlig hemoglobinnivå betydelig høyere hos behandlet ultralydstimulerte MB dyr sammenlignet med kontroll ubehandlet. 24 timer etter behandling hadde fraksjonen av funksjonelle blodårer en tendens å være høyere i behandlet ultralydstimulerte MB gruppe sammenlignet med kontroll ubehandlet. Økt blodstrømningshastighet og forandringer i strømningsretning på grunn av økt blodtrykk, noe som førte til åpning av små og store blodårer, var antydet som den mest sannsynlige årsaker. Svulster og normalt vev ved siden av svulster var likt påvirket av behandlingen. Imidlertid hadde oksygenmetning og hemoglobinnivå en tendens til å være høyere i normalt vev, noe som indikerer flere større blodårer i normalt vev. Fraksjon av CD144 piksler hadde en tendens til å være lavere 0 timer etter behandling og var betydelig høyere i behandlet ultralydstimulert MB svulster 24 timer etter behandling. Det har blitt spekulert at CD144 trenger mer tid for å bli gjenopprettet etter behandling, sammenlignet med proteiner i blod-hjerne barrierer.

Ultrasound, in combination with microbubbles (MBs), has emerged as a promising method to enhance delivery of drug-loaded nanoparticles to tumor tissues. Despite tremendous progress in the production of nanoparticles, the accumulation of nanoparticles and drugs in tumors is still insufficient. In addition, ultrasound-stimulated MBs have also been reported to affect perfusion in tumors. The aim of this study is to investigate the effects of ultrasound-stimulated MB treatment on blood perfusion and vascular permeability in subcutaneous tumors in mice. The investigation was performed by using two image modalities: photoacoustic imaging and confocal laser scanning microscopy imaging. OHS tumors were grown in the hind leg of BALB/c nude mice (n=10), randomly divided into three groups: control untreated (n=3), control MBs (n=2), and treated ultrasound-stimulated MBs (n=5) groups. For treated ultrasound-stimulated MBs and control MBs groups, a bolus SonoVue MBs was injected intravenously. For treated ultrasound-stimulated MBs group, the injection was followed by ultrasound exposure. The procedure was repeated with a new bolus injection of SonoVue for treated ultrasound-stimulated MBs and control MBs animals and another ultrasound exposure for treated ultrasound-stimulated MBs animals. Control untreated group received no treatment. Photoacoustic imaging was performed at five different timepoints, with treatment given between first and second timepoints. Fluorescein labeled lectin was injected intravenously to label functional blood vessels before animals were euthanized and tumors were excised. Frozen in liquid nitrogen tumors were cut into 30 sections each, divided into six depth levels. Tumor sections were separately immunostained for CD31 (blood vessels) and CD144 (endothelial intercellular junctions). Whole sections, stained for CD31, were imaged by confocal scanning laser microscopy performing tile scanning, while several snaps of different blood vessels in sections, stained for CD144, were acquired. Tile scan images were analyzed in ImageJ, and number of functional blood vessels and total number of blood vessels were compared. Snaps with CD144 were also analyzed in ImageJ, and number of CD144 pixels was compared to lectin pixels. Photoacoustic 3D scans were analyzed in Vevo LAB, and oxygen saturation and hemoglobin values were extracted. Mean oxygen saturation gave no significant difference between groups, and was strongly affected by isoflurane anesthesia. 15 min after treatment, mean hemoglobin level was significantly higher in treated ultrasound-stimulated MBs animals compared to control untreated. 24 h after treatment, fraction of functional blood vessels tended to be higher in treated ultrasound-stimulated MBs group compared to control untreated. Increased blood flow rate and changes in flow direction due to increased blood pressure, resulting in opening of small and larger blood vessels, were suggested as most likely reasons. Tumors and normal tissue adjacent to tumors were equally affected by treatment. However, oxygen saturation and hemoglobin level tended to be higher in normal tissue, indicating more larger blood vessels in normal tissue. Fraction of CD144 pixels tended to be lower 0 h after treatment and was significantly higher in treated ultrasound-stimulated MBs tumor 24 h after treatment. It has been speculated that CD144 needs more time to be restored after treatment, compared to proteins in blood-brain barrier.