Tumorheterogenitet og autofagiflux

Abstract

Kreftsvulster er kompliserte nettverk bestående av flere celletyper med ulike funksjoner og mekanismer, noe som beskrives som heterogenitet. I dette prosjektet ble autofagiflux, morfologi og veksthastighet til kloner av den murine brystkreftcellelinjen 66cl4 undersøkt for heterogenitet. Autofagi spiller en viktig rolle i utviklingen av kreft, og manipulering av autofagi kan være en mulig behandlingsstrategi for ulike tumorer. Det er derfor interessant å se på hvordan særlig autofagiflux varierer mellom cellene.

Cellekulturer av den opprinnelige 66cl4-cellelinjen og fem utvalgte kloner ble behandlet med autofagiinhibitoren BafA1 i forskjellige tidsintervaller, før det ble laget proteinekstrakter av cellene. Western Blott med indirekte immunfarging ble så benyttet for å separere og visualisere proteinbåndene for autofagiproteinene LC3B og p62, samt «husholdsproteinene» ERK 1/2. Membranene ble så scannet, og proteinbåndene kvantitert. Cellekulturene ble i tillegg målt og telt, og vurdert visuelt i mikroskop.

Klonene og den opprinnelige cellelinjen viste tydelige forskjeller i morfologi og veksthastighet, der to kloner skilte seg ut ved at den ene vokste raskere og den andre saktere enn den opprinnelige cellelinjen. Det ble også observert ulikheter i klonenes metabolisme, hvor særlig én forårsaket større pH-endring i vekstmediet.

De basale nivåene av p62 og LC3B normalisert mot ERK 1/2 varierte sterkt mellom hvert eksperiment, men det finnes likevel holdepunkter for at noen av klonene skiller seg fra den opprinnelige cellelinjen. Autofagiflux i klonene kunne ikke normalisert mot ERK 1/2, da det ble påvist at ERK 1/2 er betydelig påvirket av BafA1. De ikke normaliserte resultatene indikerer at autofagiflux er noe ulik hos 66cl4 og klonene. På grunn av store avvik er det ikke mulig å påvise signifikante forskjeller mellom noen av klonene og den opprinnelige cellelinjen, men internt mellom enkelte av klonene synes det å være klare ulikheter.

Ut fra disse observasjonene og resultatene er dette en indikasjon på at det er heterogenitet innad i 66cl4-cellelinjen for vekstrate, morfologi og autofagi, og det ville vært svært interessant med videre undersøkelser for både å vurdere dette nærmere og se om de andre klonene etablert fra cellelinjen viser lignende tendenser.

Cancerous tumours are complicated networks consisting of multiple types of cells with various functions and mechanisms, which is described as heterogeneity. In this project, autophagy flux, morphology, and growth rate for clones of the murine breast cancer cell line 66cl4 were examined for heterogeneity. Autophagy plays an important role in the development of cancer, and manipulation of autophagy mechanisms may be a viable treatment option for some tumours. It is therefore interesting to look at how autophagy flux varies between the clones and original cell line.

Cell cultures from the original 66cl4 cell line and five chosen clones were treated with autophagy inhibitor BafA1 for set time intervals, before protein concentrates were made from the cells. Western Blot with indirect immunostaining were then used to separate and visualise the protein bands of autophagy proteins LC3B and p62, as well as «household proteins» ERK 1/2. Membranes were then scanned, and the protein bands quantified. Additionally, the cell cultures were measured and counted, and inspected visually in a microscope.

The clones and the original cell line showed clear differences in morphology and growth rates, where two of the clones particularly stood out with one having a higher growth rate and another having a slower growth rate. Differences were also observed in the clones’ metabolism, where one clone caused a noticeable change in growth medium pH.

Base levels of p62 and LC3B normalised against ERK1/2 were highly inconsistent between experiments, and even though it is not possible to be sure, there is still reason to conclude that some of the clones are different from the original cell line. Autophagy flux in the cells could not be normalised against ERK1/2, as it is proven that ERK1/2 is strongly affected by the BafA1 treatment. The non-normalised results indicates that autophagy flux is somewhat different between clones and 66cl4. Due to big discrepancies between parallels, it is not possible to detect significant differences between some of the clones and the original cell line, but between a few of the singular clones some differences are detectable.

Based on these observations and results, there are indications of heterogeneity within the 66cl4 cell line for parameters such as growth rate, morphology and autophagy, and further investigation into this, and whether the rest of the clones shows the same tendencies, would be very interesting.