Validering av primersett for påvisning av bakterier ved universell 16S rRNA-gen PCR

Abstract

Avdeling for medisinsk mikrobiologi ved St. Olavs hospital i Trondheim benytter en universell 16S rRNA-gen PCR-analyse på pasientprøver for identifisering av bakterier som i mindre grad lar seg påvise ved dyrkning. Kjente problemer ved denne metoden er kontaminasjon av bakterier i reagenser og uønsket amplifisering av humant DNA. Disse problemene kan påvirke metodens spesifisitet og sensitivitet, og gjøre det vanskelig å tolke resultatene. Primersettet som avdelingen for medisinsk mikrobiologi benytter i dag ved 16S rRNA-gen PCR viser kryssreaktivitet med humant DNA, og avdelingen ønsker å ta i bruk nye primersett som unngår denne kryssreaktiviteten. Det ble kjøpt to nye primersett (966F og DPO) som ble sammenliknet med rutineprimerne som i dag benyttes ved avdelingen. Ti pasientprøver ble analysert ved 16S rRNA-gen PCR med de tre primersettene. Ved kapillær gelelektroforese ble det undersøkt om primersettene ga kryssreaktivitet med humant DNA, før prøvene ble sekvensert for å bestemme PCR-produktenes baseparsekvens. Resultatene fra analysering med rutineprimerne viste kryssreaktivitet med humant DNA i seks av ti prøver, mens bruk av 966F- og DPO-primersett ikke ga kryssreaktivitet i noen av prøvene. 966F-primersettet detekterte derimot bakterien Cutibacterium acnes i reagenser, noe de andre primersettene ikke gjorde. Ved bruk av DPO-primersettet var det mulig å påvise bakterien Streptococcus dysgalactiae i én prøve som de andre primersettene ikke detekterte noen bakterier i. DPO-primersettet viser en høy grad av spesifisitet ved å unngå amplifisering av humant DNA. DPO-primerne viste også en høyere sensitivitet sammenliknet med de to andre primersettene, da de dette primersettet detekterte lavere konsentrasjoner av S. aureus. Dette er noe som bør undersøkes ytterligere med tanke på mulig fortynningsfeil. En overgang til å benytte DPO-primere i avdelingens 16S rRNA-gen PCR-analyser ser ut til å minimere risikoen for kryssreaktivitet med humant DNA i prøven. Primere med høy spesifisitet vil forbedre kvaliteten av sekvenseringsresultatene, og derved øke muligheten for å kunne identifisere bakterier. Bruk av DPO-primere vil ha særlig betydning ved analyse av pasientprøver med bakterier som er utfordrende å påvise med andre analysemetoder.

A broad-range 16S rRNA-gene PCR, used on clinical samples, is an applied method at The Department of medical microbiology at St. Olavs hospital in Trondheim. Known problems associated with this method include PCR-contamination from reagents, as well as cross reactivity from human DNA in samples. These problems may affect the specificity and sensitivity of the method, making it more complicated to interpret the results. The currently used primer set at the Department of medical microbiology shows cross reactivity with human DNA. The department therefore wants to include new primer sets that avoids this cross reactivity. Two new primer sets (966F and DPO) were bought and compared with the currently used primer set. Using the three primer sets, a total of ten samples were analysed by 16S rRNA-gene PCR. The PCR products were then checked for cross reactivity with human DNA by capillary gel electrophoresis before sequencing. The sequencing determined the base pair sequence of the product. The currently used primer set showed cross reactivity with human DNA in six out of ten samples, whereas the 966F primer set and DPO showed no signs of cross reactivity at all. On the other hand, the 966F primer set showed amplification of the bacteria Cutibacterium acnes due to contamination of the reagents. In addition, DPO detected Streptococcus dysgalactiae in a sample defined as negative by the other two primer sets. The DPO primer set showed high specificity by avoiding reactivity with human DNA in the clinical samples. DPO also showed better sensitivity compared to the two other primer sets, by detecting lower concentrations of S. aureus. However, this is something that should be more thoroughly investigated due to possible dilution errors. Transitioning to the DPO primers will minimize the risk of cross reactivity and thereby improve the quality of the sequencing results. The use of DPO primers will be of particular importance in the analysis of clinical samples containing bacteria that are challenging to identify using other methods.