RT-PCR basert mutasjonsanalyse av BRCA1/2 i eggstokkreft

Abstract

Bryst- og eggstokkreft er to av de vanligste krefttypene og rammer i hovedsak kvinner. Breast cancer gene 1/2 (BRCA 1/2) er to gener der mutasjoner, både arvelige og somatiske, kan forårsake disse krefttypene. Avhengig av mutasjonsstatus i disse genene, så kan det åpne for å gi vedlikeholdsbehandling med en poly (ADP-Ribose) polymerase 1 (PARP1)-inhibitor. Dette er en farmakologisk inhibitor, som hemmer PARP enzymer. Disse enzymene har kritiske funksjoner innen reparasjon av DNA-skader. Tumorceller med en mutert BRCA1/2 variant er vesentlig mer sensitiv for PARP1-inhibitorer enn normale celler, da de ofte mangler disse reparasjonsmekanismene. PARP1-inhibitorer kan derfor benyttes som behandlingsform til bryst- og eggstokkreft.

Dagens metode for å teste mutasjoner i BRCA1/2 er basert på Ion Torrent neste generasjons sekvensering (NGS). Denne metoden kan gi usikre resultater i enkelte tilfeller, da fragmentering av nukleinsyrer er et problem i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver. Dette kan gjøre enkelte typer mutasjoner, som store eksondelesjoner, vanskelig å påvise. På bakgrunn av dette var det ønskelig å finne en metode for å kunne verifisere usikre resultater fra NGS-analyser, og det ved å benytte RT-PCR og sangersekvensering på isolert RNA fra FFPE vevsprøver.

RNA ble isolert fra tumorrike områder i tre FFPE vevsprøver med påviste eksondelesjoner, og fra tre normale prøver som kontroll. Som kvalitetskontroll ble RNA-konsentrasjonen målt og kvaliteten til prøvene ble sjekket ved real-time RT-PCR med β-actin som kontroll. Av prøvene ble cDNA-syntese og PCR med spesifikke primere gjort, før gelelektroforese ble benyttet for å kontrollere størrelsen på PCR-produkter. Til slutt ble relevante PCR-produkter sekvensert og analysert med kapillærelektroforese for å bekrefte mutasjonene.

Resultatene etter sekvensering og dataanalyse, viste at eksondelesjonene ble påvist og bekreftet med denne metoden, men resultatet var avhengige av kvaliteten på det opprinnelige prøvematerialet. Av prøvene med eksondelesjoner, så var prøve 2 av for lav kvalitet og ga ikke et tilfredsstillende resultat. Både prøve 1 og 3, samt de normale prøvene som ble benyttet som kontroller, ga forventede resultater, selv med relativt lav prøvekvalitet.

Resultatene viste at denne metoden er egnet til å påvise store eksondelesjoner i BRCA1/2 fra FFPE vevsprøver, ved bruk av RT-PCR og sangersekvensering. Den kan derfor benyttes som et alternativ til å verifisere Ion Torrent NGS-analyser, hvis disse gir usikre resultater. Det må dog tas forbehold om at metoden bare er testet på et lite antall prøver. Metoden må testes i større grad for å kunne trekke en definitiv konklusjon.

Breast and ovarian cancer are two of the most frequently occurring types of cancer, and are almost exclusively found in women. Mutations, both germline and somatic, in BRCA1/2, can cause these types of cancer. Depending on mutational status in BRCA1/2, patients with ovarian cancer can be eligible for maintenance treatment with a PARP1-inhibitor. This is a pharmaceutical inhibitor that inhibits PARP enzymes. These enzymes have important functions regarding to the repair of damaged DNA. Tumor cells with a mutated variant of BRCA1/2 are highly sensitive to this type of treatment, compared to normal cells. This is because they lack important DNA repair pathways. Because of this, PARP1-inhibitors can be used as maintenance treatment for patients with breast and ovarian cancer.

Today’s method for testing BRCA1/2 mutations are based on Ion Torrent NGS. This method may give uncertain results in some cases, because fragmentation of nucleic acids is a common source of error in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples. This can make some types of mutations, like large exon deletions, hard to verify. Because of this, it was desirable to find another way to verify these mutations and uncertain results from NGS-analyses. This was accomplished by using RT-PCR and sanger sequencing on FFPE tissue samples.

RNA was isolated from tumor rich areas in three FFPE tissue samples, with previous evidence of exon deletions, and from three normal samples used as controls. As a quality control, the RNA concentration was measured in the isolated samples, and a real-time RT-PCR reaction, with β-actin used as a control, was performed. A synthesis method using cDNA and an RT-PCR reaction was used to amplify the amount of relevant DNA in the samples, using specific primer pairs. Gel electrophoresis was implemented to check and verify the size of the products from the previous PCR reactions. Finally, sequencing using capillary electrophoresis and data analysis was used to confirm the exon deletions.

The results from the sanger sequencing and data analysis showed large exon deletions. However, the result was affected by the quality of the samples. Of the samples with exon deletions, sample 2 was of too low quality to yield any satisfactory results. However, sample 1, 3 and the samples used as controls produced sufficient results, even with a relatively low RNA quality.

The results show that this method is suited for detection of large exon deletions in BRCA1/2 genes from FFPE tissue samples, by using RT-PCR and sanger sequencing. It may therefore be an alternative method for verifying results from Ion Torrent NGS, if those results prove to be uncertain. However, a limitation of this study is the small number of samples with limited variation which needs to be considered. This method therefore needs to be tested on a larger scale to draw any definitive conclusions.