Utvikling av metode for påvisning av Lepeophtheirus salmonis nauplier (lakseluslarver) i vannprøver med bruk av real-time PCR (qPCR)

Abstract

Oppgaven var å utvikle en ny qPCR-metode for deteksjon av lakseluslarver i vannprøver som inneholder plankton. Det ble designet egne primere til spesifikke målgen for lakseluslarven. Dette ble oppnådd ved hjelp av RefSeq-databasen og «Primer-BLAST»-verktøyet til NCBI før laboratorieforsøkene startet. Det ble bestilt inn totalt fire primerpar der målet var å finne den beste kandidaten blant disse. I tillegg var primerpar 2 lokalisert innenfor primerpar 1 for å åpne muligheten for nested PCR. Det ble utført flere optimaliseringer av oppsettet. Templat-DNA-volum ble testet med volumer på 1, 2 og 3 µL. Volum på 2 µL viste seg å være det mest stabile alternativet og viste best smeltepunktskurve. Det var planlagt å kjøre en temperaturoptimalisering, men da volumoptimaliseringen ble kjørt med 58 °C og resultatene ble gode, ble det besluttet å ikke gjøre flere temperaturoptimaliseringer. Basert på resultatene, ble primerpar 1 og 4 fjernet som aktuelle kandidater da ingen av disse ga tilstrekkelige resultater. Muligheten for nested PCR var ikke lenger til stede, da både primerpar 1 og 2 ville vært nødvendig for denne typen analyse. Det ble utført optimalisering av konsentrasjon med primerpar 2 og 3. Det ble konkludert at 500 nM var det mest optimale for både forward og reverse primer for primerpar 2. For primerpar 3 var 500 nM forward og 600 nM reverse mest optimalt. Etter primeroptimalisering ble det satt opp en standardkurve og deteksjonsgrensen ble bestemt. Dette konkluderte med at primerpar 2 fikk deteksjonsgrense rundt 5*10-5 µg/µL, med slope-verdi på 3,9180, effektivitet på 80 % og R2-verdi på 0,98. Primerpar 3 fikk deteksjonsgrense rundt 5*10-5 µg/µL, med slope-verdi på 3,8817, effektivitet på 81 % og R2-verdi på 0,9954. I denne oppgaven ble det benyttet et Qubit-fluorometer for å måle konsentrasjon av DNA i prøvene som en ekstra kvalitetskontroll. Det ble utført DNA-isolering av både Lepeophtheirus salmonis nauplier (lakseluslarver) og alger av artene Isochrysis galbana og Tetraselmis subcordiformis. Det ble utført to forsøk med det optimaliserte og endelige oppsettet for å teste metoden. Det ble utført forsøk med både høy og lav konsentrasjon av alger. Basert på resultatene fra disse forsøkene kan det antas at de optimaliserte verdiene er gode nok til en vellykket påvisning av lakseluslarver i en vannprøve som inneholder plankton.

The thesis’s purpose was to develop a method to detect salmon lice larvae in a water sample containing plankton. Selected primers were designed for specific target genes in the salmon lice’s genome. This was achieved using the RefSeq database and NCBI’s “Primer-BLAST” tool before laboratorial experiments commenced. A total of four primer pairs were ordered with the goal of finding the best candidate among these. In addition, one of these primer pairs were located within another which was intended to allow for the use of nested PCR. Multiple optimizations of the setup were performed. The template DNA was tested with volumes of 1, 2 and 3 µL. A volume of 2 µL proved to be the most stable alternative and showed the best melting curve. A temperature optimization was planned, but as the volume optimization was performed with a temperature of 58°C and the results were optimal, the decision was made to not perform any further temperature optimization. Based on these results, primer pairs 1 and 4 were removed as potential candidates, since none of these provided optimal results. The option to use nested PCR was also no longer present as it relied upon the usage of both primer pair 1 and 2. An optimization of the concentrations for primer pairs 2 and 3 were performed. A concentration of 500 nM was concluded to be the most optimal for both the forward and reverse primer in primer pair 2. Meanwhile, 500 nM forward and 600 nM reverse were the most optimal concentrations for primer pair 3. After the primer optimization, a standard curve was created and limit of detection was determined. This concluded that primer pair 2 had detection limit 5*10-5 µg/µL, slope value of 3.9180, efficiency of 80% and R2 value of 0.98. Primer pair 3 had detection limit 5*10-6 µg/µL, slope value of 3.8817, efficiency of 81% and R2 value of 0.9954. In this thesis a Qubit fluorometer was used to measure the concentrations of DNA in the samples as a quality control. DNA isolation was performed on both Lepeophtheirus salmonis larvae and algae of the Isochrysis galbana and Tetraselmis subcordiformis species. Two analyses were performed with the final optimized setup to test the assay. An analysis with a high concentration of algae and one with a low concentration of algae were performed. Based on the results of these analyses it can be assumed that the optimized values are good enough for a successful detection of salmon lice larvae in a water sample containing plankton.