Investigation into the presence of polyphenols and carotenoids in the two seaweed species Alaria esculenta and Saccharina latissima, with a focus on extracting, purifying, and characterizing the xanthophyll fucoxanthin.

Abstract

Kultivering og utnyttelse av tare som en bærekraftig kilde til fornybare ressurser har de siste årene fått mye oppmerksomhet. Forskning på antioksidanter som polyfenoler og karotenoider fra bruntare har spesielt fått mye oppmerksomhet på grunn av de potensielle bioaktive virkningene og positive helseeffektene de har. Undersøkelser av hvordan disse stoffene fra tare effektivt kan ekstraheres, renses, isoleres og analyseres, er et steg i retning av en mer effektiv bruk av hele tareplanten. Hovedmålet med denne masteroppgaven har derfor vært å ekstrahere og karakterisere karotenoider og polyfenoler fra bruntare ved å undersøke tilstedeværelsen av små molekyler i artene Alaria esculenta og Saccharina latissima.

Taremateriale med ulik forbehandling ble i et små-skala forsøk ekstrahert med aceton og metanol. De to ulike forbehandlingene var 1) materiale som ble frysetørket og kvernet og 2) materiale som ble behandlet med enzymer, frysetørket og kvernet. Råekstrakt ble analysert med kjernemagnetisk resonans spektroskopi (NMR) og væskekromatografi-masse spektrometri (LC-MS) og for å kunne sammenligne prøvene. Fersk tare (W) ble ekstrahert med acetone og påfølgende metanol, og FD-materiale ble ekstrahert med aceton i en bulk-ekstraksjon. Råekstrakt ble renset ved hjelp av væske-væske partitionering, adsorpsjons-resin (XAD-16), og væskekromatografi medium (LH-20). NMR og LC-MS ble brukt til å evaluere og veilede ekstraksjons- og renseprosessen og som analytisk verktøy for karakterisering.

FD og ET materialet fra begge artene viste indikasjoner på polyfenoler og karotenoider ved ekstraksjon med metanol og aceton i små-skala forsøket. Sammenligning av NMR dataen viste flere signaler som indikerte tilstedeværelsen av polyfenoler og karotenoider ved ekstraksjon med aceton enn med metanol. Flere og mer intense slike signaler ble observert i prøver av Alaria esculenta enn i Saccharina latissima. Avfetting, med bruk av n-heksan ble ikke oppnådd, da fettstoffer kunne sees i de avfettede prøvene etter partisjoneringen og signaler som indikerte polyfenoler og karotenoider ble observert i heksan-fasen. Signaler konsistente med aldehyder ble observert i både råekstrakt og i heksan-fasen, noe som kan være en indikasjon på oksidasjon og nedbrytning av karotenoider.

Rensing ved hjelp av XAD-16 resin kan være en effektiv måte å produsere fucoxanthin-rike prøver, da NMR data indikerte tilstedeværelse av karotenoidet fucoxanthin i W-materiale av S. latissima ekstrahert med aceton. Fucoxanthin kunne imidlertid ikke observeres i prøvene renset med kolonnekromotografi med (LH-20). Dette mistenkes å komme av oksidativ degradering av fucoxanthin. I fraksjonene eludert fra kolonnen kunne det observeres signaler som indikerte polyfenoler. Ytterligere arbeid trengs for å rense og karakterisere disse stoffene.

En forbindelse ble renset fra A. esculenta FD-materiale fra bulk-ekstraksjonen. Forbindelsen ble karakterisert ved korrelasjoner i 1H-13C HSQC, 1H-1H COSY og 1H-13C HMBC spekter og bestemt til å være fucoxanthin. Denne dataen indikerte også at fettstoffer var tilstede. Det mistenktes at fucoxanthin er acetylert med fettstoffer og finnes som fucoxanthin ester. Ytterligere rensing behøves for å isolere fucoxanthin og kunne teste for biologisk aktivitet og en dypere forståelse av forbindelsen. Det ble ikke karakterisert noen polyfenoler.

Ytterligere forskning trengs for en effektiv rensing og karakterisering av karotenoider og polyfenoler fra A. esculenta og S. latissima. Disse burde fokusere på å hindre oksidering og nedbrytning av de ønskede stoffene.

In recent years, the cultivation and utilization of seaweed as a sustainable source of renewable resources has gained a lot of attention. Research on antioxidants such as carotenoids and polyphenols from brown seaweed has especially been of interest due to their potential bioactivities and health benefits. Investigation of the polyphenols and carotenoids present in seaweed and developing strategies to extract, purify, isolate, and analyze them, is a step towards a more efficient utilization of the seaweed plant. The main objective of this thesis has been to extract and structurally characterize carotenoids and polyphenols from brown seaweed by investigating the small molecules present in Alaria esculenta and Saccharina latissima.

In a small-scale experiment, seaweed material with two different pretreatments, 1) wet material freeze-dried and ground before extraction (FD) and 2) wet material treated with enzymes freeze-dried and ground before extraction (ET), were extracted in acetone and methanol. The crude extracts were compared with nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to evaluate the extracts. Bulk extractions of wet material (W) with acetone and subsequently with methanol and of FD-material with acetone were conducted. Crude extracts were purified by liquid-liquid partitioning, adsorption resin (XAD-16), and liquid chromatography medium (LH-20). NMR and LC-MS were used to evaluate and guide the extraction and purification process and as a tool for structure elucidation.

FD- and ET-material from both species showed indications of polyphenols and carotenoids when extracted with methanol and acetone in the small-scale experiment. By comparing NMR data, extraction with acetone showed more signals indicating carotenoid and polyphenolic moieties than extraction with methanol. Alaria esculenta showed more signals and signals of higher intensity of these types of molecules compared to Saccharina latissima. Complete defatting, using n-hexane, was not achieved as lipids were still associated with the targeted compounds after defatting and signals of targeted compounds appeared in the hexane phase. Signals consistent with aldehydes were observed in both crude extract and hexane phase and could indicate oxidation and degradation of carotenoids.

Purification with XAD-16 resin can be an effective way of producing a fucoxanthin-rich extract as signals that indicate the presence of the carotenoid fucoxanthin were observed by NMR in W-material from S. latissima from the bulk extraction with acetone. However, fucoxanthin was unable to be purified using column chromatography (with LH-20). It is suspected this is due to oxidative degradation of fucoxanthin. Signals indicating polyphenolic moieties were observed in NMR data of some of the fractions eluted off the column. Further work is required for purification and structural characterization.

A compound was purified from A. esculenta FD-material from bulk extraction. The complete structure of the compound was characterized by correlations in 1H-13C HSQC, 1H-1H COSY and 1H-13C HMBC spectra and was determined to be fucoxanthin. The data also indicated the presence of lipids. It is suspected that fucoxanthin in the sample is acetylated with fatty acids and is present as a fucoxanthin ester. Additional purification steps are needed to purify fucoxanthin further to allow biological activity testing and deeper understanding of its functions.

In conclusion, further work is needed on methods to efficiently purify and characterize carotenoids and polyphenols from A. esculenta and S. latissima. These should include measures to prevent oxidation and degradation of the targeted compounds.