Morphological changes in the frustule of Thalassiosira pseudonana by genetic manipulation and cultivation conditions

Abstract

Kiselalger er den mest utbredte og diversifiserte undergruppen av fytoplankton. De bidrar til omtrent en femtedel av verdens fotosyntese, og produserer årlig mer karbon enn alle verdens regnskoger til sammen. De finnes overalt hvor det er nok lys og næringsstoffer. Den sylindriske modellorganismen Thalassiosira pseudonana består av to halvdeler som overlapper hverandre, og hver halvdel er bygd opp av en valve og tilhørende girdle bands. Celleveggen, som kalles en frustule, består av hydrert silica, og er bygd opp av lag med tredimensjonelle strukturer fra nano- til mikrometerskala. Disse strukturene danner et komplekst og artsspesifikt mønster av porer, hvis morfologi avhenger av ulike proteiner of organiske komponenter, slik som silaffiner, silacidiner, silicaniner og langkjededepolyaminer (long chain polyamines). Det komplekse mønsteret av porer produseres kostnadseffektivt ved biologisk selvmontering i store mengder, noe som gjør de spesielt nyttige for nanoteknologisk industri. For å kunne manipulere cellene til a danne visse strukturer som kan brukes til nanotegnologiske formål, er det viktig at vi forstår mekanismen og komponentene som er invovert i syntesen fullstendig. Man kan optimalisere ønskede nanostrukturelle paramtere ved å endre dyrkningsbetingelser eller ved genetisk manipulasjon.

Denne rapporten dekker et tredelt eksperiment som undersøker morfologien til Thalassiosira pseudonanas frustule. Først ble det forsøkt å danne enkle og doble knock out mutante T. pseudonana cellelinjer av Tp23191 og Tp6330 i gruppe IV i silicanin-proteinfamilien. Dette forsøket benyttet seg av geneditering med CRISPR-Cas9 systemet for å indusere knock out mutasjoner i disse genene. Seks ulike målsekvenser brukt, to i hvert gen (Tp6330PAM1 og -2 og Tp23191PAM2 og -4) for enkle knock out mutanter, og to målsekvenser som var identiske i begge genene (TP23191-6330PAM1 og -2) for doble knock out mutanter. Celler som hadde gitt indikasjoner på mutasjoner i tidligere arbeid hadde blitt replatet, og screening ble utført på disse koloniene. Ingen mutanter ble identifisert og isolert. Det andre forsøket omhandlet et lokaliseringsstudie, hvor to gener som koder for proteiner i silicanin-proteinfamilien, Tp23191 i gruppe IV og Tp20931 i gruppe III, ble forsøkt tagget med det fluoriscerende proteinet mTurq. Det ble brukt flere kloningsstrategier for å forsøke å sette sammen plasmidet som skulle bli brukt for å transformere T. pseudonana-celler med disse genene tagget med mTurq, men ingen var vellykkede. Til slutt ble morfologien til frustulen i T. pseudonana studert under påvirkning av kadmium og aluminium. Scanning electronmikroskopering (SEM) bilder av frustulen av T. pseudonana-celler som vokste uten påvirkning av metaller (kontroll), med 25 μg/L aluminium (Al_25) tilsatt, og 5 μg/L kadmium (Cd5) tilsatt ble analysert. Resultatene viste at diameter av frustulen, fultoportulae, rimoportulae, cribrumporer og bredden av costae var signifikante ulike fra kontrollprøvene i begge prøver, med unntak av diameteren til cribrumporene i Al25 og diameteren til fultoportulae og rimoportulae i Cd5.

Diatoms is the most abundant and diversified subgroup of phytoplankton, and contributes to about one-fifth of the world's photosynthesis, creating more organic carbon annually than all terrestrial rain forests combined. They can be found in water wherever there is enough light and nutrients. The centric model diatom Thalassiosira pseudonana is built up of two halves, each consisting of a valve and its associated girdle bands. The frustule, made of amorphous, hydrated silica consists of layers of three-dimensional structures from nano- to micrometer scale, creating a complex, species-specific pattern of pores. Its morphology depends on different proteins and organic components, such as silaffins, silacidins, silicanins, and long chain polyamines. Because of their highly controlled nanopatterns that are produced cost-efficiently by biological self-assembly in large quantities, they are especially useful for nanotechnological applications. In order to be able to manipulate the cells to create certain structures that can be used for nanotechnological purposes, it is important that we understand the mechanism and the components involved in the synthesis of the frustule completely. Cultivation conditions and genetic manipulation can help optimize desired nanostructural parameters.

This report covers a three-part experiment involving the morphology of the frustule of the diatom Thalassiosira pseudonana. Firstly, I attempted to create single and double knock out T. pseudonana cell lines of Tp23191 and Tp6330 in group IV of the silicanin protein family. This experiment used gene editing with the CRISPR-Cas9 system to induce knock out mutations in target regions adjacent to protospacer adjacent motifs (PAM) sites. In total, six different target sites were chosen, two in each gene (Tp6330PAM1 and -2 and Tp23191PAM2 and -4) for the single knock out mutants, and two PAM sites that were identical in both genes (TP23191-6330PAM1 and -2) for the double knock out mutants. Screening was performed on replated cells that had previously given indications for mutations, but no mutants could be identified and isolated. The second experiment was a localization study, I attempted to tag two genes encoding proteins in the silicanin protein family, Tp23191 in group IV and Tp20931 in group III with the fluorescence protein mTurq. Several cloning strategies were attempted, but none proved to be successful. Lastly, the effects of cadmium and aluminium on the morphology of the frustule was studied. Image analysis of scanning electron microscopy (SEM) images of the frustule of T. pseudonana cells growing in ESAW medium with no added metal (control), 25 μg/L aluminium (Al_25) and 5 μg/L cadmium (Cd_5) showed that the valve, fultoportulae, rimoportulae and cribrum pore diameter, and costae width was significantly different from the control in both samples, except cribrum pore diameter in Al_25, and fultoportulae and rimoportulae diameter in Cd_5.