Functional Properties and Effect of Ultrafiltration and in vitro Digestion on Antioxidant Properties in Saithe (Pollachius virens) Backbone Hydrolysates

Abstract

I 2019 produserte Norge 3,55 millioner tonn sjømat hvorav 0,96 millioner tonn var biprodukter. Disse biproduktene anses ikke som direkte salgbare, men de kan omgjøres til nye produkter for humant konsum. Biprodukter fra hvit fisk (torsk, hyse, lange, brosme og sei) er relativt dårlig utnyttet (61 % utnyttelse) sammenlignet med biprodukter fra lakseindustrien og har derfor et stort potensial. Et forslag for å øke utnyttelsen av biprodukter fra hvit fisk er å produsere fiskeproteinhydrolysat (FPH) ved enzymatisk hydrolyse. Fiskeproteinhydrolysat er næringsrike og har vist gode funksjonelle og bioaktive egenskaper tidligere og kan derfor ha potensial som funksjonelle matingredienser eller som kosttilskudd for humant konsum. Det er også vist at små peptider (1-5 kDa) ofte har høyere bioaktivitet, som antioksidantaktivitet, og at slike kan bli oppkonsentrert ved hjelp av membranfiltrering.

For å undersøke en mulig utnyttelse av biprodukter fra hvit fisk, ble seiproteinhydrolysater (SPH) produsert med enzymatisk hydrolyse av ryggbein fra sei. Målet med denne masteroppgaven var å undersøke funksjonelle- og antioksidantegenskaper i SPH, og videre ble det undersøkt hvordan antioksidantegenskapene ble påvirket av membranfiltrering og in vitro fordøyelse. Sammenhengen mellom strukturelle egenskaper og antioksidantaktivitet ble analysert ved å undersøke hydrolysegraden, molvektsfordelingen og aminosyresammensetningen. Antioksidantaktiviteten ble undersøkt med analysene 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), ferric reducing ability of plasma (FRAP) og oxygen radical absorbance capacity (ORAC). Seiproteinhydrolysatene ble ultrafiltrert to ganger (UF1 og UF2) med to forskjellige membraner basert på molvekten for å avgjøre hvilke peptidstørrelser som viser høyeste antioksidantaktivitet. Ved UF1 ble det filtrert med en 150 kDa og deretter en 4 kDa membran, mens ved UF2 ble det filtret med en 150 kDa og så en 2 kDa membran.

Seiproteinhydrolysatene hadde en hydrolysegrad på 18 %, en høy proteinløselighet (100 %) og en høy forekomst (300 mg/g) av små peptider (2-1 kDa). På grunn av det høye innholdet av små peptider, hadde SPHene dårlig vannbindingsevne og emulgerende egenskaper sammenlignet med andre FPHer. Hydrolysegraden kan derfor være for høy for ønskede funksjonelle egenskaper. Molvektsfordelingen viste at UF1 separerte peptidene basert på størrelse, der fraksjonen <4 kDa hadde høyere konsentrasjon av mindre peptider. Videre ble det funnet et høyt innhold av essensielle aminosyrer som gjør at SPHene har en høy næringsmiddelverdi. Resultatene fra antioksidantaktivitetanalysene viste at SPH kan hemme ABTS-radikaler, kan redusere frie radikaler og at de har ORAC-aktivitet. Ultrafiltreringen økte FRAP og ORAC til en viss grad, hvor FRAP-verdiene økte i de store fraksjonene (>150 kDa, 150-2 kDa) og ORAC-verdiene økte i <4 kDa fraksjonen. Analysen ABTS, viste at ultrafiltreringene ikke økte egenskapen til å hemme ABTS-radikaler og antyder at en synergisk effekt av flere peptidstørrelser er en fordel. Resultatene i denne oppgaven kan indikere at det ikke er nødvendig å ultrafiltrere for å øke konsentrasjonen av antioksidantpeptider for å øke antioksidantaktiviteten. Til slutt, in vitro fordøyelse av SPHene reduserte ABTS- og FRAP-aktivitetene, mens ORAC-aktiviteten økte hos noen av SPHene. Utifra analysene, kan det derfor antas at hydrolysater fra biprodukter til hvit fisk kan ha potensiale til å bli brukt som et kosttilskudd, men mest sannsynlig høyere potensiale til å bli brukt som en multifunksjonell matvareingrediens.

In Norway, the annual production of seafood was 3.55 million tons in 2019, whereof 0.96 million tons ended up as by-products. These by-products are not regarded as directly saleable but can be recycled into new products for human consumption. By-products from white fish (cod, haddock, ling, tusk, and saithe) are relatively poorly utilized (61 %) compared to aquaculture. One way to improve the utilization of white fish by-products is to produce fish protein hydrolysate (FPH) by enzymatic hydrolysis which is nutritious and has previously shown good functional and bioactive properties. Further, it has been shown that small peptides (1-5 kDa) have higher bioactive activity like antioxidant activity and that they can be concentrated with membrane filtration.

To investigate the potential for utilization of by-products from white fish, saithe protein hydrolysates (SPH) were produced by enzymatic hydrolysis of backbone from saithe. The aim of the thesis was to investigate the functional properties, and antioxidant activity of the SPHs, and explore how the antioxidant activity was affected by membrane filtration and in vitro gastrointestinal digestion. The functional properties analysed, were solubility, water holding capacity, and emulsifying properties. The relationship between structural properties and antioxidant activity was analysed by examining the degree of hydrolysis, the molecular weight (MW) distribution and the amino acid composition. The antioxidant activity was analysed with the assays: (2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), ferric reducing ability of plasma (FRAP), and oxygen radical absorbance capacity (ORAC)). Further, the SPHs were ultra-filtrated twice (UF1 and UF2) with two different MW cut-offs (MWCO) to evaluate which MW showed the best antioxidant activity. For ultrafiltration (UF) 1, the SPHs were filtrated with a 150 kDa and 4 kDa MWCO membrane. For UF 2, the SPHs were filtrated with a 150 kDa and 2 kDa MWCO membrane.

The SPHs had a degree of hydrolysis of 18 %, a high solubility of 100 %, and a high abundance (300 mg/g) of small peptides (2-1 kDa). The abundance of small peptides resulted in poor water holding capacity and emulsifying properties in the SPHs compared to other FPHs. Hence, production of SPH with a lower DH might favour the functional properties. The MW distribution showed that UF1 was able to separate peptides into fractions based on size. Further, the SPHs and the fractions had a high proportion of essential amino acids and thus, a high nutritional value. The results from the antioxidant activity assays showed that the SPHs can work as radical scavengers by reducing the free ABTS+• radical, have reducing ability of free radicals, and have ORAC. The UFs increased FRAP and ORAC to some extent, where the FRAP was increased for the larger fractions (>150 kDa, 150-2 kDa) and ORAC was increased for the <4 kDa fraction. The ABTS assay showed that the UFs did not improve the free radical scavenging activity and imply that an additive effect of peptides with different sizes might have the best radical scavenging activity. In short, the results in this thesis indicate that UF is probably not necessary for concentrating bioactive peptides to increase antioxidant properties. Lastly, in vitro digestion decreased ABTS and FRAP activities, and increased ORAC for some of the SPHs. Thus, the SPHs have shown that white fish by-product hydrolysates have the potential to be used as nutraceuticals. However, white fish by-product hydrolysates have most likely a higher potential to be used as a multi-functional food ingredient.