Growth Characterization and Mass Spectrometric Metabolic Profiling of Escherichia coli During Recombinant Protein Production

Abstract

Sammendrag

Escherichia coli er en mye brukt vertsorganisme for rekombinant proteinproduksjon (RPP). Likevel presenterer denne bakterien fremdeles ulemper som hemmer proteinutbyttet. Utvikling og optimalisering av rekombinante bioprosesser gir utfordringer på flere nivåer. Et lenge oversett tema er hvordan dragning av biosyntetiske forløpere mot RPP byrder den metabolske tilstanden til vertscellen, blant annet ved å utløse metabolske tilpasninger som fremkaller en rekke stressresponser, og til slutt resulterer i redusert cellemasse så vel som kvaliteten og mengden av protein.

MetaboProt er et prosjektet tar sikte på å utvide kunnskapen om RPP-forårsaket metabolsk belastning i E. coli ved hjelp av massespektrometrisk metabolittprofilering og utvikling av programvarebaserte metabolske nettverk. Det forventede resultatet er kunne å identifisere flaskehalser som kan løses for å forbedre effektiviteten av RPP.

Som en del av pilotfasen til MetaboProt prosjektet, var målet med denne oppgaven å etablere og bruke en metabolsk profileringsplattform for å optimalisere spesifikke utfordringer under RPP. Rekombinante E. coli BL21-stammer med to ulike styrker av det induserbare XylS/Pm ekspresjonssystemet og forskjellige plasmidkopinumre ble kultivert for karakterisering av vekst. Metabolsk profilering av en mCherry-produserende og den tilsvarende negative kontrollen ble utført for å undersøke endringer i den sentrale karbonmetabolismen etter induksjon.

Resultatene fra denne studien støtter tidligere funn av økt metabolsk belastning i høyere produserende stammer ved påvist nedgang i vekstrater og endelig dannelse av biomasse med både forhøyet plasmiddose og økt uttrykkingsstyrke. Funn fra endometabolomisk analyse viste endringer i reaksjonsspor involvert i den sentrale karbonmetabolismen etter induksjon av RPP, mest fremtredende vist gjennom lave nivåer av aminosyrer og økte konsentrasjoner av metabolitter i TCA-syklusen. I motsetning til dette ble nukleosidfosfater, glykolytiske og PPP metabolitter påvist ved lavere nivåer i en mCherry-produserende stamme både før og etter induksjon.

Denne oppgaven danner en innledende fase mot systematisk optimalisering av RPP i E. coli, i tillegg til å etablere et grunnlag for videre studier i MetaboProt prosjektet.

Abstract

Escherichia coli is a widely used host organism for recombinant protein production (RPP). Nevertheless, this bacterium still presents drawbacks that hampers protein yields. The development and optimization of recombinant bioprocesses presents challenges on several levels. A long-overlooked topic is how drainage of biosynthetic precursors towards RPP burdens the metabolic state of the host cell, triggering metabolic adaptations that elicits a series of stress responses, and ultimately reduces the formation of biomass as well as the quality and quantity of protein.

The MetaboProt project has a long-term goal of widen the knowledge about the RPP-derived metabolic burden in E. coli by means of mass spectrometric metabolite profiling and software-based metabolic networking. The expected outcome is to identify bottlenecks that can be addressed by targeted engineering to improve RPP efficiency.

As part of the pilot stage of the MetaboProt project, this thesis aimed at establishing and using a metabolic profiling platform for optimization of specific challenges during RPP. Recombinant E. coli BL21 strains harboring two different strengths of the inducible XylS/Pm expression system and various plasmid copy numbers were cultivated for growth characterization. Metabolic profiling of one mCherry producing strain and the corresponding negative control was performed to investigate changes in the central carbon metabolism following induction.

The results of this study supports previous discoveries of increased metabolic load in higher-producing strains by detected decline in growth rates and final biomass formation with both elevated plasmid dosage and increased expression strength. The findings from endometabolomic analysis demonstrated rerouting of pathways involved in the central carbon metabolism following RPP, most prominently shown by depleted abundance of amino acid pools and increased levels of TCA cycle intermediates. Contrary, nucleoside phosphates, glycolytic and PPP metabolites were detected at depleted levels in a mCherry producing strain both prior to and after induction.

This thesis forms an initial stage towards systematic optimization of RPP in E. coli, as well as establishing a basis for further MetaboProt-related studies.