Exploring the metabolic adaptations in CHO-K1 cells cultured in serum free media and the effect of adaptation method utilized

Abstract

Serum er en flytende forbindelse avledet fra blod. Vanligvis hentes det fra ubedøvede fostre av storfe, og brukes som et supplement til basale vekstmedier. Det er en udefinert blanding med animalsk opprinnelse, noe som resulterer i problemer når det gjelder reproduserbarhet av vitenskapelig forskning, forurensning, proteinrensing og alvorlige etiske spørsmål. Målet med denne studien var å undersøke hvordan kinesisk hamster eggstokk (CHO)-K1 celler ble påvirket av vekst i serumfrie medier, og om tilpasningsmetoden som ble brukt, spilte en betydelig rolle for cellene etter tilpasning.

I denne studien var den første oppgaven å tilpasse CHO-K1-celler til vekst i det kjemisk definerte, serumfrie mediet (SFM) CDOptiCHO ved bruk av to forskjellige tilpasningsmetoder kalt direkte og sekvensiell. Levedyktighet og morfologi ble nøye overvåket gjennom hele prosessen for å sikre vellykket tilpasning. Under de senere trinnene i tilpasningsprosessen ble celler tatt fra både direkte og sekvensiell tilpasningsmetode for å kultivere dem som celler forankret til overflaten som vokser i serumfritt medie. Da konsentrasjonen av føtalt kalveserum (FBS) kom under et visst nivå, festet imidlertid ikke cellene seg, og forsøket ble ansett som mislykket. For å visualisere vekstmønsteret til direkte og sekvensielle tilpassede celler, i tillegg til kontrollcellene kultivert som celler forankret til overflaten og supplementert med FBS, ble en vekstkurve konstruert over et tidsrom på seks dager. Det viste tydelige tegn på redusert vekst i celler dyrket som en suspensjon i SFM, og også en reduksjon i vekst av sekvensielt tilpassede celler i forhold til direkte. ¹H NMR-analyse ble brukt til å kvantifisere mengden av de ekstracellulære metabolittene glukose som forbrukes og laktat som skilles ut i vekstmediet hver dag over en tidsperiode på seks dager. Glukoseforbruket gikk ned i sekvensielle celler i forhold til direkte, og forbruket i direkte var høyere i forhold til kontrollen. Laktatproduksjonen var omtrent lik i direkte, sekvensiell og kontroll. Til slutt ble endometabolomet undersøkt gjennom capIC-MS/MS og LC-MS/MS for å se hvordan de intracellulære metabolittene ble påvirket av serumfri vekst som en suspensjon og ved den anvendte tilpasningsmetoden. Den generelle trenden var lavere konsentrasjon av metabolitter i celler dyrket i SFM i forhold til kontroll, med unntak av asparagin (Asn) og itakonsyre (IA). Videre hadde direkte celler en samlet økning i metabolitter i forhold til sekvensiell, med unntak av metabolitter som tilhører sitronsyresyklusen (TCA), som forble omtrent den samme.

Funnene presentert i denne studien indikerer at den anvendte tilpasningsmetoden representerer en signifikant forskjell i egenskapene til cellene etter vellykket tilpasning, der den direkte tilpasningen er den foretrukne. Videre indikerer det at vekst i SFM som en suspensjonskultur resulterer i en total reduksjon i metabolittkonsentrasjoner og vekst.

Serum is a liquid compound derived from blood, commonly collected from unanesthetized cattle fetuses and used as a supplement to basal growth media. It is an ill-defined mixture with animal origin, resulting in problems regarding reproducibility of scientific research, contamination, protein purification and serious ethical issues. The aim of this study was to investigate how Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cells were affected by growth in serum free media (SFM), and if the adaptation method utilized played a significant role for the cells after adaptation.

In this study, the first task was to successfully adapt CHO-K1 cells to growth in the chemically defined, SFM CDOptiCHO by the use of two different adaptation methods called direct and sequential. Viability and morphology were closely monitored through the whole process, to ensure successful adaptation. During the later steps of the adaptation process, cells were taken from both direct and sequential cultures to seed them as adherent cells growing in SFM. However, as fetal bovine serum (FBS) concentration reached below a certain level, the cells did not attach, and the attempt was considered unsuccessful. To visualize the growth pattern of direct and sequential adapted cells, in addition to the control cells growing as FBS supplemented adherent cells, a growth curve was constructed over a time span of six days. It showed clear signs of reduced growth in cells cultured as a suspension in SFM, and also a reduction in growth of sequential adapted cells relative to direct. ¹H NMR analysis was used to quantify the amount of the extracellular metabolites glucose being consumed and lactate being excreted in the growth medium each day over a time period of six days. Glucose consumption went down in sequential cells relative to direct, and the consumption in direct was higher relative to the control. Lactate production was approximately similar in direct, sequential and control. Finally, the endometabolome was investigated through capIC-MS/MS and LC-MS/MS to see how the intracellular metabolite pools were affected by serum free growth as a suspension and by the adaptation method utilized. The overall trend was lower metabolite pools in cells grown in SFM relative to control, with the exception of asparagine (Asn) and itaconic acid (IA). Furthermore, direct cells had an overall increase in metabolites relative to sequential, with the exception of metabolites belonging to the tricarboxylic acid cycle (TCA) cycle, which remained approximately the same.

The findings presented in this study indicate that the adaptation method utilized represent a significant difference in the traits of the cells after successful adaptation, where the direct approach is the preferred one. Furthermore, it indicates that growth in SFM as a suspension culture results in an overall decrease in metabolite pools and growth.