Characterisation of Macromolecule Diffusion in Internally Set Calcium Alginate Gels

Abstract

Alginat er et biomaterial ofte brukt som immobiliseringsmatriks på grunn av dens lave immunogenitet, høye og kontrollerbare porøsitet, at det finnes naturlig i store mengder og at prosesseringskostnadene er lave. For at alginatgeler skal kunne brukes for cellekultivering og som depot for medisiner, må diffusjonskarakteristikkene i geler og for molekyler med ulike egenskaper studeres slik at diffusjonen til medisiner, celleprodukter og komponenter i immunsystemet kan forutsees. I denne studien ble effekten av forandring i både egenskapene til kalsium-alginatgeler og egenskapene til det diffunderende molekylet på diffusjon studert. Kalsium-alginatgeler ble tillagd gjennom intern gelingsmetode. Diffusjon av FITC-Dekstraner og IgG ble studert ved bruk av FRAP, mens diffusjon av nanopartikler ble studert ved å spore partiklenes bevegelse. FRAP er en relativt rask og enkel metode som kan sikre at gelens integritet og at forholdene er de samme. Repeterte eksperiment avslørte god reproduserbarhet i resultatene. Allikevel har denne metoden hatt noen utfordringer i unøyaktige målinger på grunn av utilsiktet bleking, på grunn av en lang blekingsfase, og bleking under gjenopprettingsfasen av FRAP Diffusjon av FITC-Dekstran ble studert i kalsium-alginatgeler med varierende konsentrasjon av kalsium og alginat. Ved å forandre disse parameterne ble det oppdaget en liten forskjell i FITC-Dextranenes diffusjon, selv om denne forskjellen ikke er veldig fremtredende. En økende alginatkonsentrasjon fra 0.5% til 5% viste ingen effekt på 150kDa dekstrans diffusjonsrate, men viste en synkende trend i dekstranets mobile fraksjon, fra rundt 60% for 0.5% alginatgeler til rundt 50% for 3% alginatgeler. Dette indikerer at høyere alginatkonsentrasjoner fører til geler som funksjonelt immobiliserer en større andel av de diffunderende molekylene. En forandring av kalsiumkonsentrasjonen fra 7.5mM til 60mM medførte ingen store forandringer i andelen mobile molekyler, men viste en økning i diffusjonsrate fra 7,5mM til 15mM kalsium. Dette indikerer at kalsiumkonsentrasjoner under 15mM kan føre til forstyrrelser av diffusjon, mens kalsiumkonsentrasjoner over 15mM ikke gir endringer av gelen som kan forstyrre diffusjon. Det har blitt vist at forandringer i gelens egenskaper kan føre til forandringer i gelens struktur slik at det har en effekt på diffusjon, men dette er kun tilfellet for gelene med lavere kalsium- og alginatkonsentrasjoner. For å studere diffusjon av forskjellige molekyler ble FITC-Dekstraner med ulik molekylvekt, fra 3-5kDa til 150kDa, studert i kalsium-alginatgeler (15mM kalsium, 1% alginat). Resultatene fra denne studien viste at FITC-Dekstranenes mobile fraksjoner så ut til å følge en trend der de større dekstranene hadde en større andel av funksjonelt immobile molekyler sammenlignet med de mindre dekstranene. De immobile fraksjonene varierte fra rundt 40% for 150kDa dekstran til rundt 10% for 3-5kDa dekstran. Diffusjonsratene viste høyere rater for 3-5kDa, mens 40kDa, 70kDa og 150kDa dekstranene hadde lignende rater (henholdsvis rundt 1,8 µm2/s og 0,8 µm2/s). Dette eksperimentet har vist at forandringer i det diffunderende molekylet har større effekt på dets diffusjon sammenlignet med forandringer av gelens egenskaper. Studiene av diffusjon av nanopartikler med en størrelse på 0,1 µm i diameter viste at partikler med denne størrelsen ikke har noen bevegelse i kalsium-alginatgeler (15mM kalsium, 1% alginat). Dette indikerer at det kan være en størrelsesgrense for diffusjon. For å undersøke om kalsium-alginatgeler fungerer som immunbarrierer ble diffusjon av IgG studert. Resultatene fra denne studien viste at IgG har lignende diffusjonskarakteristikker som 150kDa FITC-Dekstran. IgG har en molekylvekt omtrentlig lik 150kDa, men dets faktiske størrelse er mindre enn hos 150kDa dekstran, så det var derfor forventet at IgG ville ha høyere diffusjonsrate og mobil fraksjon. Dette kan indikere at IgG interagerer med kalsium eller alginat i gelen slik at dets diffusjon reduseres. Det at IgG faktisk kunne diffundere gjennom gelen viste at disse kalsium-alginatgelene ikke nødvendigvis er gode immunbarrierer mot IgG alene. Kalsium-alginatgeler ble sammenlignet med en annen type hydrogel, gelatin, for å sammenligne diffusjonskarakteristikker. Lignende diffusjonsrater av 40kDa FITC-Dekstran i de to hydrogelene indikerer at de kan ha samme poreviskositet og dermed lignende hydrogel egenskaper, til tross for strukturelle forskjeller, vist av ulike mobile fraksjoner i de to hydrogelene. Denne studien har vist at FRAP kan brukes som en effektiv metode for å avdekke funksjonelt immobile fluorescerende molekyler i en gel som i en løsning ville vært mobile. Det ble også oppdaget at det ikke er store forandringer i diffusjonsrate mellom gel og løsning.

Alginate is a biomaterial frequently used as immobilisation matrix because of its low immunogenicity, high and controllable porosity, abundancy, and low processing cost. For alginate gels to be used for cell cultivation and drug depots, diffusion characteristics of gels with different properties and of molecules with different characteristics must be investigated to predict the diffusional behaviour of drugs, cell products and immune agents. In this study, the influence on diffusion of both the gel properties of calcium alginate gels and the properties of the diffusing molecule were studied. Calcium alginate gels were made through internal gelation. Diffusion of FITC-Dextran and IgG was determined using Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), whereas diffusion of nanoparticles was investigated by tracking their movement. FRAP is a relatively fast and simple method that ensures that the gel integrity and the conditions are the same. Repeated experiments revealed high reproducibility of results. However, accuracy of measurements was found to be affected by unintentional bleaching, due to a long bleaching phase, and bleaching during recovery. The diffusion of FITC-Dextran was studied in calcium alginate gels with varying concentration of calcium and alginate. It was discovered that changing these parameters had a small effect on the diffusion of FITC-Dextran, although this influence was not very prominent. Increasing the alginate concentration from 0.5% to 5% showed no change in the 150kDa FITC-Dextran’s diffusion rate but showed a decreasing trend in the mobile fractions, from around 60% for the 0.5% alginate gel to around 50% for the 3% alginate gel, suggesting that higher alginate concentrations cause gels with structures that are able to functionally immobilise a larger portion of the diffusing molecules. Changing the calcium concentration from 7.5mM to 60mM did not result in any change in the portion of mobile molecules but did result in an increased diffusion rate from 7.5mM to 15mM calcium. This suggests that calcium concentrations below 15mM may interfere with diffusion, whereas calcium concentrations above 15mM do not alter the gel so that it influences diffusion. Hereby, changing the properties of the gel can change its structure to influence diffusion extensively, but this is only the case for the gels with low calcium and alginate concentrations. To investigate change in diffusion between different molecules, FITC-Dextrans with different molecular weights, ranging from 3-5kDa to 150kDa, were studied in calcium alginate gels (15mM calcium and 1% alginate). This showed that the mobile fractions of the FITC-Dextran follow a trend where the larger dextrans seem to have a larger portion of functionally immobile molecules compared to the smaller dextrans. The immobile fractions ranged from around 40% for the 150kDa dextran to around 10% for the 3-5kDa dextran. The diffusion rates showed higher rates for the 3-5kDa dextran and similar rates for the 40kDa, 70kDa and 150kDa dextrans (around 1.8 µm2/s and 0.8 µm2/s, respectively). This experiment showed that changes in the diffusing molecule had a larger impact on diffusion compared to changes in gel properties. Studying diffusion of nanoparticles with a 0.1µm diameter showed that particles this size had absolutely no movement in the calcium alginate gels (15mM calcium, 1% alginate), suggesting that there is a size limit of diffusion. To investigate if calcium alginate gels may function as immune barriers, diffusion of IgG was studied. Surprisingly, IgG had similar diffusion characteristics as 150kDa FITC-Dextran. IgG has a molecular weight of approximately 150kDa but its size is smaller than the dextran’s so it would be expected that IgG had higher diffusion rates and mobile fractions. It was suggested that IgG may interact with calcium or alginate in the gel causing its decreased diffusion. The fact that IgG did diffuse through the gel did show that this alginate may not be a good immune barrier towards IgG by itself. Calcium alginate gels were compared to another hydrogel, gelatine, to compare diffusion characteristics. Similar diffusion rates of 40kDa FITC-Dextran in the two hydrogels indicate that despite some structural differences, shown by different mobile fractions, the hydrogels may have the same pore viscosity and therefore share some similarities in their hydrogel properties. In conclusion, this thesis has demonstrated that FRAP can be used as an effective method for detecting the entrapment of fluorescent molecules in a gel that in solution are mobile. It was also shown that the diffusion rate in gel and solution are similar.