Preparation, characterization, and solution properties of chitosan-b-dextran diblocks

Abstract

Målet med denne masteroppgaven var å lage og karakterisere av kitosan-b-dekstran-diblokker og undersøke deres egenskaper i løsning. Det er kjent at løseligheten til kitosan-oligomerer med lav FA er sterkt avhengig av pH i løsningen, noe som fører til aggregering og utfelling når pH > pKa. Det var derfor av stor interesse å undersøke hvordan koblingen av en vannløselig dekstran-blokk med kitosan påvirker løseligheten til den resulterende diblokken, sammenlignet med ren kitosan.

Størrelseseksklusjons-kromatografi (SEC) ble brukt for å skaffe smale fraksjoner av kitosan-oligomerer (DnM) og aktiverte dekstran-oligomerer (Dextm-PDHA), for opplagingen av kitosan-b-dekstran-diblokker. Grunnen til at dextran-oligomerer ble brukt som den første blokken i opplagingen av kitosan-b-dekstran-diblokker var på grunn av ønsket om å utnytte den høyt reaktive M-enheten i koblingsreaksjonen. Fullstendig de-N-acetylerte oligomerer med den svært reaktive M-enheten som reduserende ende (DnM) ble laget ved å bryte ned kitosan med lav FA ved bruk av sub-støkiometrisk mengde salpetersyrling (HNO2). Opprensing av isolerte DnM-oligomerer kan være vanskelig på grunn av reaksjon mellom de høyt reaktive M-enhetene og aminogruppene på D-enhetene til kitosan. Dette kan føre til selv-forgreining gjennom en Schiff-basereaksjon og påfølgende nedbryting av M-enheten (pH-avhengig). To mulige måter å forbedre opplagingen av isolerte kitosan-oligomerer (DnM) ble derfor utforsket. Dette førte til en ny rensemetode, noe som resulterte i økt bevaring av M-enheten på den reduserende enden, sammenlignet med tidligere metoder.

Koblingsreaksjonen og reduksjonsreaksjonen for kitosan-b-dekstran-diblokkene ble studert med time course NMR for å finne ut hvor lang tid reaksjonene tok slik at en preparativ protokoll kunne etableres. Koblingen av kitosan-oligomerer og dektran-PDHA ved bruk av molforholdet 1:1, var en rask reaksjon som resulterte i høyt utbytte av diblokker (≥ 85 %). I samsvar med litteraturen, ble det bare dannet asykliske konjugater (E- og Z-oksimer). Kinetikkforsøket for reduksjonen avslørte at reduksjonen av diblokkene, ved bruk av reduksjonsmiddelet α-Picoline boran (PB), var betydelig langsommere sammenlignet med koblingsreaksjonen.

Løseligheten av kitosan-oligomerer ble undersøkt ved å måle lysspredning som en funksjon av pH ved dynamisk lysspredning (DLS). Aggregering ble observert ved omtrent pH 7, som var i godt samsvar med tidligere litteratur. Ytterligere økning av pH resulterte i utfelling. Løseligheten til kitosan-b-dekstran-diblokker ble deretter undersøkt med samme metode, noe som resulterte i at kitosan-b-dekstran-diblokkene viste seg å ha løselighet over et større pH-område sammenlignet med kitosan-oligomerer, da det ikke ble observert utfelling ved pH 10. Partikkelstørrelsen til diblokkene observert ved pH 6 og pH 10 antydet at det ikke kunne være frie kjeder i løsningen. I tillegg kan innsnevringen av intensitetsfordelingen og økningen i lysspredning fra pH 6 til pH 10 indikere strukturering av diblokkene. En hypotese er strukturering av kitosan og dannelsen av en micellar struktur med en dekstran-corona. Ytterligere studier bør gjøres for å bekrefte dette. En stabilitetsstudie av kitosan-b-dekstran-diblokker laget uten redusering indikerte at reversering av diblokkene forekommer ved lave pH-verdier.

The overall aim of this master thesis was to prepare and characterize chitosan-b-dextran diblocks and to investigate their properties in solution. It is generally known that the solubility of chitosan oligomers with low FA is strongly pH-dependent, leading to aggregation and precipitation when pH > pKa. It was therefore of great interest to investigate how terminal conjugation of a water-soluble dextran block with chitosan affected the solution properties of the resulting diblock, compared to that of pure chitosan.

Size-exclusion chromatography (SEC) was used to obtain narrow fractions of chitosan oligomers (DnM) and activated dextran oligomers (Dextm-PDHA), for the preparation of chitosan-b-dextran diblocks. The decision to use the dextran oligomers as the first block in the preparation of chitosan-b-dextran diblocks, was due to the desire to utilize the high reactivity of the pending aldehyde of the M residue in the block conjugation. Fully de-N-acetylated oligomers with the highly reactive M residue (DnM) was prepared by degradation of chitosan with low FA using a sub-stoichiometric amount of nitrous acid (HNO2). Purification of isolated DnM oligomers can be troublesome due to reactions of the highly reactive M residues with the free amino groups of the D residues. This can lead to self-branching through Schiff base formation and subsequent degradation of the M residue (pH-dependent). Two possible methods to improve the preparation of purified and isolated chitosan oligomers (DnM) were therefore explored. This led to the development of an optimized purification method, which resulted in higher preservation of the M residue at the reducing end, compared to previous methods.

The conjugation and reduction reaction of chitosan-b-dextran diblocks were studied by time course NMR to establish the course of the reactions as a tool to develop a preparative protocol. The conjugation of DnM oligomers to Dextm-PDHA using a 1:1 molar ratio was a rapid reaction and resulted in high yields of diblocks (≥ 85 %). In agreement with literature, only acyclic conjugates (E- and Z-oximes) were formed. The reduction kinetic study revealed that the reduction of the oximes, by the reducing agent α-Picoline borane (PB), was significantly slower compared to the conjugation reaction.

The solution properties of pure DnM oligomers were studied by measuring the intensity of the scattered light as a function of pH by dynamic light scattering (DLS). Aggregation was observed at approximately pH 7, which was in good agreement with previous literature. Additional increase in pH resulted in precipitation. The solution properties of D28M-PDHA-Dext52 diblocks were further investigated using the same approach. The study revealed that the chitosan-b-dextran diblocks remained soluble over a larger pH range compared to the pure DnM, as no precipitation was observed at pH 10 for the diblocks. The size of the diblock particles formed at pH 6 and pH 10 suggested that there were no free chains in the solution. In addition, narrowing of the intensity distribution and slight increase in light scattering intensity from pH 6 to pH 10 may indicate structuring. A hypothesis is self-assembly of chitosan and the formation of a micellar structure with a dextran corona. However, further studies are needed to confirm this. Finally, a stability study of chitosan-b-dextran diblocks prepared without reduction indicated that the diblock structures are reversible at low pH values.