Characterization and industrial application of artificial promoter and 5' UTR sequences in Escherichia coli and Vibrio natriegens

Abstract

Vibrio natriegens er en gramnegativ proteobakterie som i den siste tiden har fått mye oppmerksomhet på grunn av en rask doblingstid på under ti minutter. Den er fremvok- sende platform for syntetisk biologi, og det er økende interesse for utvikling av verktøy for genmodifisering og molekylærbiologi.

Ved bruk av gen-utrykksmetoden GeneEE har kunstige 5' regulatoriske sekvenser (bestående av promoter og 5' utranslaterte regioner [5' UTR]) blitt produsert sammen med reporter- genet super folding fluorescent protein (sfGFP). I denne oppgaven har 29 kunstige promoterer og 5' UTR (ArtPromU) sekvenser blitt karakterisert i kombinasjon med reporter-genet rødt fluorescerende protein (mCherry) i Escherichia coli og V. natriegens.

Tre av de 29 ArtPromU-sekvensene ble testet for ekspresjon av M-MulV revers transkrip- tase i samarbeid med ArcticZymes Technologies ASA. Et av konstruktene, ArtPromU1, ga suksessfull ekspresjon av aktiv M-MulV revers transkriptase. Dette viser potensialet for industriell bruk av tilfeldige regulatoriske sekvenser ved GeneEE-metoden. Overordnet sett viser resultatene i oppgaven potensialet for bruk av GeneEE-metoden for industriell produksjon av rekombinante proteiner.

Vibrio natriegens is a gram-negative marine proteobacterium that recently regained atten- tion mainly due to its rapid doubling time of less than 10 minutes. Due to this attention, it is considered to be an emerging chassis for synthetic biology applications and therefore there is a growing interest to develop molecular methods and synthetic biology tools al- lowing genetic engineering.

Artificial 5' regulatory sequences (consisting of promoter and 5' untranslated region [5' UTR]) have been created in combination with the reporter gene super folding green fluo- rescent protein (sfGFP), relying on the use of the gene expression engineering (GeneEE) method.

In this thesis, 29 artificial promoter and 5' UTR (ArtPromU) sequences have been suc- cessfully characterized in combination with the reporter gene red fluorescent protein (mCherry) in Escherichia coli and V. natriegens.

Among the 29 ArtPromU sequences, three of the constructs have been tested for expres- sion of M-MulV reverse transcriptase in cooperation with ArcticZymes Technologies ASA. One of the constructs, ArtPromU1, led to successful expression of active M-MulV reverse transcriptase, which shows the possible application of random regulatory sequences by the GeneEE method for their industrial use. In general, these results underline the possi- ble further application of the GeneEE method in recombinant protein production industry.