Reporter genes for relative quantification of promoter strength and c-di-GMP in Pseudomonas fluorescens.

Abstract

Alginat er en industrielt viktig polymer som består av de to monomerene mannuronsyre og guluronsyre. Denne polymeren kan brukes til å transportere legemidler inn i kroppen, sårheling og muligens i vevsregenerering. Alginat kommer hovedsakelig fra brunalger, der det fungerer som en strukturell komponent. I senere år har det blir gjort flere studier på produksjon av alginat av bakterier fra arter som Pseudomonas og Azotobacter. Målet er å kunne modifisere og skreddersy alginatet som bakteriene produserer slik at det oppfyller kravene industrien har til alginatet. Målet med denne oppgaven var å lage en mutant som kunne brukes til å kontrollere alginatproduksjonen i Pseudomonas fluorecens. Reportergen var et viktig verktøy og ble også brukt til å evaluere en metode for relativ kvantifisering av c-di-GMP i P. fluorescens.

I den eksperimentelle delen av prosjektet ble det utført en reporter gen studie som et verktøy i vurderingen av promotorstyrke. Reportergen som ble testet var RFP, CFP, YFP og GFP. Promotorene som ble undersøkt var PBAD, Ptrc, Pm, PmG5 og Pm ML1- 17. Den IPTG-induserbare promotoren Ptrc, viste seg å også bli transkribert i stasjonærfasen. En alginatproduserende stamme av P. fluorescens med denne promotoren foran algC, et gen viktig for dannelsen av forløperen i alginat biosyntesen, ble konstruert gjennom homolog rekombinering. Alginatkonsentrasjonen i den nye stammen ble målt i kulturer der Ptrc både var uindusert, og indusert til ulike tidspunkt. Det ble konkludert med at målingen burde gjentas på grunn av uforventede resultat. Likevel ble det observert at induksjon med IPTG muligens ikke hadde den ønskede effekten.

Et system for å måle c-di-GMP, et molekyl viktig for regulering av biosyntesen av alginat, ble testet i P. fluorescens. Resultatene viste at det sannsynligvis fungerer bra, men at en stamme som overproduserer MucR vil være viktig for å verifisere resultatene ettersom MucR er et c-di-GMP produserende enzym og vil da fungere som en positiv kontroll. En slik stamme ble ikke laget på grunn av problemer i kloningsprosessen. Det ble oppdaget at promotoren PFP2, som regulerer de fluorescerende genene i c-di-GMP reportersystemet, også transkriberes i stasjonærfasen. En mulig korrelasjon mellom denne og Ptrc ble anbefalt å undersøke videre.

Alginate is an industrially important polymer composed of the two monomers mannuronic and guluronic acid. The polymer can be used in drug delivery systems, wound healing and possibly in tissue regeneration. Alginate is mainly derived from brown algae, where it serves as a structure-forming component. However, in recent years, several studies on the production of alginate by bacteria like Pseudomonas and Azotobacter has been performed. The goal is to be able to modify and tailor the bacterial alginate to the industry’s needs. This study aims to contribute to this by using reporter genes to study the strength of promoters, which could be used to create a mutant that in turn could be used to control alginate production tightly. Reporter genes could also be used to evaluate a method for relative quantification of c-di-GMP in P. fluorescens.

In the experimental part of this project, a reporter gene assay was carried out as a tool in order to investigate different promoters. Reporter genes tested were RFP, CFP, YFP and GFP. The promoters investigated were PBAD, Ptrc, Pm, PmG5 and Pm ML1- 17. Ptrc, which is induced by IPTG, was found to be transcribed in the stationary phase. An alginate-producing strain of P. fluorescens SBW25 with this promoter in front of algC, a gene important for synthesis of the precursor in the biosynthesis pathway, was constructed through homologous recombination. The concentration of alginate was measured in this strain in cultures without IPTG, and with addition of IPTG at different time points. No conclusions could be drawn from this measurement and it was recommended to repeat the assay. However, it was observed that induction of Ptrc with IPTG may not have had the desired effect.

A system for measuring c-di-GMP, important for regulation of the biosynthesis, was tested in P. fluorescens. The results from this study indicated that it likely functions well in P. fluorescens SBW25. However, a MucR-overproducing strain would be necessary to confirm this as it would serve as a positive control considering MucR is a c-di-GMP synthesizing enzyme. Attempts at making such a strain were unsuccessful due to problems with cloning. It was discovered that the PFP2 promoter which regulates the fluorescent genes in the c-di-GMP reporter system, was also transcribed in the stationary phase. A possible correlation between Ptrc and PFP2 was recommended to explore in further studies.