SMAC-mimetic induced cell death in LPS-pretreated human macrophages

Abstract

Betennelse er en biologisk respons i kroppsvevet forårsaket av skadelig stimuli. For å opprettholde homeostase i kroppen er det viktig å nøye regulere immuncellene. Dysregulert aktivitet av en immuncelletype som heter makrofager kan resultere i kronisk betennelse og avvikende patogenrespons. Reseptor-interagerende serin-threonin protein kinase 1 (RIPK1) er sentral for reguleringen av betennelse og celledød i makrofager. RIPK1 er nøye regulert av ubiquitinering av cellulære hemmere av apoptose protein (cIAP) 1 og 2. Disse fungerer som en bryter mellom celleoverlevelse og celledød. SMAC-etterlignere (SMer) er små molekyler som spesifikt hemmer IAPene og er under klinisk testing som kreftbehandling. Dersom IAPene blir hemmet fører dette til deubiquitinering av kinasen og induserer RIPK1-avhengig celledød. Det er nyttig å ha kunnskap om SM-indusert celledød for å forstå hvordan det kan anvendes i behandling av sykdommer. I dette prosjektet undersøkte vi hvordan SM virker på makrofager under ulike betingelser. En mer presis forståelse av disse mekanismene kan føre til nyskapende terapier for behandling av betennelsessykdommer.

Lipopolysakkarid (LPS) er en bestanddel av celleveggen til gram-negative bakterier. Den binder seg til vertsreseptoren TLR4 for å aktivere førstelinjen i kroppens immunforsvar og forbereder immunsystemet på påfølgende responser. Forbehandling med LPS i humane makrofager økte cytotoksisiteten til birinapant-indusert celledød in vitro. Vi observerte ikke samme effekt med LCL-161, en annen SM. Dette antyder at birinapant var mer potent til å indusere celledød enn LCL-161. I tillegg til å teste LPS, ble også TNF-α forbehandling testet siden begge aktiverer NF-kappaB signalisering. Forbehandling med TNF-α potenserte ikke birinapant-indusert celledød. Dette antyder at LPS har en spesifikk effekt i makrofager. I tillegg ble det observert IL-1beta produksjon i birinapant stimulerte makrofager som ble forbehandlet med LPS. Stimulering med LPS i 6 timer økte nivåene av det anti-apoptotiske proteinet c-FLIP i cellene. Immunoblott-analyser viste økt protein nivåer av caspase-3, caspase-8 og GSDMD p43 kløyvingsprodukter når birinapant-stimulerte makrofager fikk LPS forbehandling. Til tross for høye nivåer av c-FLIP i cellen, ser det ut til at caspase-8 fremdeles var i stand til å utføre celledød. Denne celledøden var mest sannsynlig apoptose. For å oppsummere viser vi i dette arbeidet at LPS forbehandling potenserer birinpant sin cytotoksisitet i humane makrofager, og kort forbehandling var tilstrekkelig.

Inflammation is a biological response in body tissue due to harmful stimuli. In order to maintain homeostasis in the body, immune cells need to be tightly regulated. Dysregulated activity of the immune cells called macrophages result in chronic inflammation and aberrant pathogen response. The receptor-interacting serine-threonine protein kinase 1 (RIPK1) is a central regulator of inflammation and cell death in macrophages. RIPK1 is tightly regulated by ubiquitination of cellular inhibitor of apoptosis protein (cIAP) 1 and 2 which acts as a switch between cell survival and death. SMAC-mimetics (SMs) are small molecules which specifically inhibit IAPs and are under clinical trials for treatment of cancer. Inhibition of the IAPs results in deubiquitylation of the kinase and induction of RIPK1-dependent cell death. Knowledge about SM-induced cell death is necessary in order to understand how it can be used for treatment of diseases. In this project we investigate how SM works in macrophages under different conditions. A more precise understanding of these mechanisms can lead to novel therapeutic approaches for treating inflammatory diseases.

Lipopolysaccharide (LPS) is a cell wall component of gram-negative bacteria. It binds to the host receptor TLR4 to activate first-line immune responses and prepare the immune system for subsequent responses. Pretreatment by LPS in healthy human macrophages increased the cytotoxicity of birinapant-induced cell death in vitro. We did not observe the same effect with LCL-161, another SM, suggesting that birinapant was more potent to induce cell death. In addition to LPS, pretreatment by TNF-α was also tested since both activate NF-kappaB signaling. TNF-α-pretreatment did not potentiate birinapant-induced cell death suggesting that LPS acts specific in macrophages. In addition, some production of IL-1beta was observed in birinapant-stimulated macrophages pretreated with LPS. Stimulation by LPS for 6 hours also increased the levels of the anti-apoptotic protein c-FLIP in the cells. Immunoblot analysis showed increased protein levels of caspase-3, caspase-8 and GSDMD p43 cleavage products when birinapant-stimulated macrophages were pretreated with LPS. Despise high c-FLIP levels, caspase-8 seemed to still be able to execute cell death, which most likely was apoptosis. In conclusion, we here showed that LPS-pretreatment potentiated birinapant cytotoxicity in human macrophages and short pretreatment was sufficient.