Host range expansion of phage cocktails: automation and study of Appelmans protocol

Abstract

Imens antibiotikaresistens sprer seg globalt, har bakteriofager fått fornyet oppmerksomhet som alternativ behandlingsmåte for bakterielle infeksjoner. Dette prosjektet tar for seg to aspekter i utviklingen av bakteriofager (også kalt fager) for fagterapi; isolering av bakteriofager, og adapsjon av fag-blandinger til nye bakterielle stammer. Fem fager ble isolert fra et kloakkrenseanlegg ved å bruke Escherichia coli-stammer fra ECOR-samlingen som verter. Sammen med fem andre fager fra et tidligere prosjekt, ble vertsbreddene til alle fagene testet på alle de 72 stammene i ECOR. Interaksjonsnetterket ble analysert, og ECOR-stammer isolert fra ikke-menneskelige verter var i større grad immune mot fagene enn stammer isolert fra menneskelige verter. Tre fager ble så kombinert i en cocktail som ble evolvert på 10 utvalgte ECOR-stammer gjennom en automatisert protokoll basert på Appelmansprotokollen. Disse ECOR-stammene ble også sjekket for profager. Etter 30 runder av protokollen hadde vertsbredden til cocktailen økt fra 3/10 til 5/10 utvalgte stammer, og i tillegg utvidet seg 44% på hele ECOR-samlingen. To vertsbreddemutanter ble isolert fra den evolverte cocktailen og sammenlignet med de originale cocktailfagene ved bruk av elektronmikroskop (TEM). Basert på disse resultatene er det sannsynlig at vertsbreddemutantene stammer, enten helt eller delvis, fra profager i ECOR-stammene. Tidligere studier av Appelmansprotokollen har ikke undersøkt effekten av profager. I tillegg til disse resultatene ble et inkuberingsskap med UV-sterilisering og temperaturog fuktighetskontroll designet og konstruert rundt en Opentrons OT-1 robot som ble programmert til a utføre protokollen. Dette designet kan være nyttig for andre prosjekter.

As the post-antibiotic era looms, bacteriophages are receiving renewed attention as an alternative to antibiotics. This study examines two aspects of developing phages for phage therapy; isolation of bacteriophages, and an automated protocol for adaption of a phage cocktail to targeted bacterial strains.

First, five phages were isolated from municipal sewage on Escherichia coli strains from the standard ECOR library. Along with five previously isolated strains, the host range of each phage was tested upon the ECOR library. The structure of the resulting interaction network revealed both nestedness and modularity, and ECOR strains isolated from human hosts showed higher phage susceptibility than strains isolated from non-human hosts. Secondly, three selected phages were combined in a cocktail and subjected to an automated host range expansion protocol upon 10 ECOR strains based on Appelmans protocol. These ECOR strains were also screened for prophages. The final phage cocktail’s host range expanded from 3/10 to 5/10 target strains, and observed a 44% increase in host range when tested upon all 72 ECOR strains.

Two host range mutants were isolated from the final cocktail and compared to the original cocktail phages using transmission electron microscopy. Based on these results, it seems likely the host range mutants, partially or completely, are descended from prophages resident within their ECOR hosts. Previous studies of Appelmans protocol have not reported the impact of prophages.

In addition to these results, a sterile incubation cabinet with temperature and humidity control was constructed around an Opentrons OT-1 pipetting robot programmed to carry out the automated version of Appelmans protocol. This design may have practical applications outside of phage cocktail host range expansion.