Evaluation of glycosyltransferase activity by heterologous expression in selected deletion strains of Xanthomonas campestris

Abstract

Mange bakterielle arter kan produsere verdifulle eksopolysakkarider (EPS), som er veldig nyttig for en rekke applikasjoner i mat-, helse-, jordbruk- og forbruksindustrien. De fleste mikrobielle EPS-er har smale bruksområder på grunn av deres begrensede reologiske egenskaper. Framskritt i syntetisk biologi og genteknologi har banet veg for skreddersydde EPS-er som en lovende måte å fylle dette behovet på. En lovende bakteriestamme til denne bruken er Xanthomonas campestris pv campestris, som produserer EPS-en xantan. Xantan produseres via den såkalte Wzx/Wzy-avhengige ruten, som bruker glykosyltransferaser (GT-er) for å produsere den repeterende enheten til xantan.

I denne studien ble det undersøkt om det er mulig å introdusere fremmede GT-er fra artene Kozakia baliensis SR-745 og Komagataeibacter sucrofermentans DSMZ 15973 for å gjenopprette funksjonen av genene gumH, gumK og gumM i X. campestris LMG 8031 (Xcc). Dette ble utført ved heterolog ekspresjon i mutasjonsstammene Xcc∆gumH, Xcc∆gumK og Xcc∆gumM. I tillegg ble gjeninnføring av stammenes originale gener undersøkt ved heterolog ekspresjon. Utbyttet og veksten i stammene med gjeninnførte gener ble målt og sammenlignet med sine opprinnelige mutasjonstammer og vill-type X. campestris. For å bestemme vellykket restaurering av xantanvariantene, ble EPS-ene analysert ved å utføre reologiske målinger, målinger av molekylærvekt, sammenligning av 1H-NMR-spekter, analyse av monomersammensetning og analyse av pyruvat- og acetatinnhold.

Vekstforsøk av stammene viste høyere vekstrater for mutasjonsstammene enn de restaurerte stammene, noe som indikerer en metabolsk belastning i cellen påført av plasmidet for heterolog ekspresjon og et skifte i karbonutnyttelse fra polysakkarid til biomasse. Utbyttet økte i alle restaurerte stammer sammenlignet med dens opprinnelige stamme, og beregninger av produktivitet viste sammenlignbare produktiviteter for alle de gjenopprettede stammene. Analyse av monomersammensetningen ble utført ved bruk av HT-PMP, og sammenligning av 1H-NMR spektra ble brukt for å bestemme fullstendig gjenopprettede avgreininger i stammene. For Xcc∆gumK ble forkortet avgreining vist. Reologiske målinger av viskositet viste sammenlignbare trender for xantan og de restaurerte stammene ved høy stress-rate, med unntak av en avvikende måling, som indikerer evnen fremmede GT-er har til å opprettholde xantanproduksjon i cellen.

Det er nødvendig å kultivere bakteriestammene under kontrollerte forhold i bioreaktorer for å kunne bestemme vekst, utbytte og produktivitet mer nøyaktig. Det er også nødvendig å undersøke mer grundig om integrering i kromosomet kan føre til økt vekst og utbytte, samt senke den metabolske belastning som påføres cellen. I tillegg er det nødvendig å undersøke om gener med ikke-identisk funksjon kan brukes for å utrykke andre GT-er, noe som er lovende for framtidig produksjon av skreddersydde polysakkarider.

Many bacterial strains are able to produce value-added exopolysaccharides (EPSs) of huge interest for a range of applications in food, medicine, agriculture, and consumer goods industries. Many microbial EPSs are narrowly suited for special applications due to their imparted rheologies. Advances in synthetic biology and genetic engineering have paved the way for tailor-made EPS as a highly promising approach to fill these gaps. One strain used for this is Xanthomonas campestris pv campestris, which produces the EPS xanthan by the so-called Wzx/Wzy dependent pathway, which utilizes glycosyltransferases (GTs) to assemble its pentasaccharide repeating unit.

In this study, the possibility of introducing non-native GTs from the strains Kozakia baliensis SR-745 and Komagataeibacter sucrofermentans DSMZ 15973 to restore function of the genes gumH, gumK and gumM in X. campestris LMG 8031 (Xcc) by heterologous expression in the deletion strains Xcc∆gumH, Xcc∆gumK and Xcc∆gumM was examined. The reintroduction of the native genes by heterologous expression was also investigated. The yield and growth of the restored strains were determined and compared to their parental strains, and the wild-type (WT) X. campestris. To determine successful xanthan restoration the EPSs were analyzed by rheological measurements, molecular weight measurements, 1H-NMR spectroscopy comparison, analysis of the monomer composition, pyruvate and acetate analysis on the EPS produced by the restored strains.

Growth analysis indicated higher growth rates for deletion strains than the restored strains, indicating metabolic stress as a result of the expression plasmid and a shift in carbon flux from polysaccharide to biomass production. The yield increased in all restored strains compared to the parental strain, and productivity calculations showed comparable productivities for all restored strains. Monomer composition analysis by HT-PMP and comparison of 1H-NMR spectra suggested fully restored side chains in the measured samples, and truncated side chain in Xcc∆gumK. Rheological measurements of viscosity showed similar trends as natural xanthan for all the restored strains at high shear rates, with the exception of one outlier, suggesting that non-native glycosyltransferases are able to restore the native function in the cell.

It is necessary to cultivate the strains under controlled conditions in bioreactors to be able to accurately determine growth, yield, and productivity. It should be further investigated if chromosomal integration increases the yield and decreases the metabolic burden, as well as the implementation of genes with non-identical function as the native glycosyltransferase, which shows great promise for the production of tailor-made polysaccharides in the future.