Establishment and characterization of artificial promoter and 5′UTR sequences in Escherichia coli and Vibrio natriegens

Abstract

Forutsigbar og konsekvent regulering av protein produksjon er avgjørende når syntetiske genetiske kretser designes, og ved stor-skala industriell produksjon. For å oppnå dette er det nødvendig å identifisere eller designe promoter og 5′UTR sekvenser som fører til forutsigbar protein-produksjon.

Målet ved denne masteroppgaven var å etablere og karakterisere kunstige ikke-induserbare promoter og 5′UTR sekvenser som førte til kontinuerlig gen-uttrykkelse i Vibrio natriegens og Escherichia coli, og sammenligne funksjonaliteten av disse sekvensene i de to organismene. Etableringen og bruken av Vibrio natrigens, som ikke er en modellorganisme for molekylærbiologi er fortsatt i tidlige faser. Grunnet dette måtte metoder for bruk av organismen etableres for PhotoSynLab gruppens laboratorie-miljø før etableringen av promoter og 5′UTR bibliotekene. I denne avhandlingen er Gene Expression Engineering (GeneEE) metoden demonstrert i Vibrio natriegens, og resulterte i funksjonelle kunstige promoter og 5′UTR sekvenser. Fordelene ved å bruke Vibrio natriegens ble demonstrert og tilskrevet den korte generasjonstiden som er essensiell både ved forskning hvor tid er mangelvare og ved stor-skala bioteknologisk industri, økonomisk og miljømessig sett. PhD kandidat Lisa Tietze utførte og etablerte flere metoder som muliggjorde etableringen av Vibrio natriegens. Flere medlemmer av laboratoriegruppen bidro ved å forsøke å bruke organismen til andre eksperimentelle mål. Det konstruerte plasmidet pACYC-200N SD inneholdt en kunstig promoter og 5′UTR DNA sekvens bestående av 200 tilfeldige nukleotider med en Shine-Dalgarno-sekvens (GGAG). Etableringen av 36 unike og funksjonelle promoter og 5′UTR sekvenser var identifisert og karakterisert ved måling av grønt fluorescerende protein (GFP) og sekvens-analyse. Sammenligning av normaliserte GFP-uttrykkelsesnivåer I Escherichia coli og Vibrio natriegens viste at protein-produksjonen var variable og konsekvent høyere I Escherichia coli. I Escherichia coli var hoveddelen av promoter og 5′UTR sekvensene aktivert under sen eksponentiell til stasjonær vekstfase. Det er nødvendig å utføre flere eksperimenter med større datasett for å trekke konklusjoner ved sekvens-analysen, og vekst-eksperimenter for Vibrio natriegens. Sekvens-analysen som ble utført in silico av den nettbaserte softwaren BRPOM og Improbizer førte til inkonsekvente resultater. Mulige ulikheter i de to organismenes transkripsjonssystemer og ved transkripsjons-initiering ble synliggjort.

Predictable and consistent regulation of protein production is crucial when designing synthetic genetic circuits and for industrial scale productions. To achieve this, it is necessary to identify or design promoter and 5′UTR sequences which produce proteins at a predictable time-points.

The goal of this thesis was to establish and characterize artificial constitutive promoter and 5′UTR sequences in Vibrio natriegens and Escherichia coli, and to compare the functionality of these sequences in the two organisms. The establishment and use of the non-model organism Vibrio natriegens for molecular biology research are still in the early days and methods for working with the organism had to be established for the PhotoSynLab group laboratory environment previous to the establishment of the promoter and 5′UTR libraries. In this thesis, the Gene Expression Engineering method was demonstrated to work well in Vibrio natriegens resulting in functional artificial constitutive promoter and 5′UTR sequences. The advantages working with Vibrio natriegens was demonstrated and attributed to the rapid growth time, which is important both in research where time is invaluable and large-scale biotechnology industry both economically and environmentally. PhD candidate Liza Tietze performed and established several methods making the establishment of Vibrio natriegens possible. Several other members of the laboratory group contributed by attempting to use the organism for other research goals. The constructed pACYC-sfGFP 200N SD plasmid contained an artificial promoter and 5′UTR sequence of 200 random nucleotides containing a Shine-Dalgarno sequence (GGAG). The establishment of 36 unique functional promoter and 5′UTR sequences was identified and characterized by fluorescence measurement of the green fluorescent protein and sequence analysis. Comparison of normalized GFP expression levels in Escherichia coli and Vibrio natriegens showed that the protein production was variable and consistently higher in Escherichia coli. In Escherichia coli the majority of the promoter and 5′UTR’s were activated during the late exponential to stationary growth phase. Further experiments with a larger dataset are needed to draw definite conclusions on the sequence analysis result and growth experiments for Vibrio natriegens. The sequence analysis performed in silico by the online software BPROM and Improbizer resulted in inconsistent predictions. The possibility of different functionality of the gene transcription systems of the two organisms for the process of transcription initiation were indicated.