CRISPR-Cas Based Genome Editing for in-vivo Biopolymer Engineering in Paenibacillus polymyxa

Abstract

Mange bakterier har evnen til å produsere eksopolysakkarider. Disse polysakkaridene har viktige funksjoner for cellen, men har også vist lovende egenskaper for bruk i industrien. Det eksisterer mange forskjellige typer polysakkarider, med ulik kjemisk struktur. Ulikhetene i den kjemiske strukturen gir polysakkarider med forskjellige funksjoner og derfor også nye antatte anvendelser. Bruk av genredigering kan øke produksjonsutbyttet og gi muligheten til å lage skreddersydde polysakkarider. Paenibacillus polymyxa er i stand til å produsere en eksopolysakkarid som kalles Paenan. Denne polysakkariden har mange interessante egenskaper og kan gi opphav til flere nye anvendelser for industrien. Et CRISPR-Cas9 plasmid, som heter pCasPP, har blitt konstruert for å utføre målrettede genetiske endringer i P. polymyxa, og det har blitt brukt for å få en bedre forståelse av synteseveien til Paenan.

I denne studien har CRISPR-Cas9 blitt brukt for å slette to gener og erstatte ett gen. De to genene, pepM og pepN, som koder for glykosylhydrolaser i Paenan-klusteret blir slettet. Eksopolysakkarider ble produsert fra de to stammene med slettet gen, og dette ble sammenliknet med eksopolysakkarider produsert av villtypen. Det andre målet med oppgaven er å slette pepF-genet som koder for en glykosyltransferase. Dette genet blir byttet ut med et gen som koder for en annen glykosyltransferase i Xanthomonas campestris. Dette kan gi en indikasjon om hvordan den kjemiske strukturen til Paenan kan bli endret. Det blir også studert om andre stammer av Paenibacillus har muligheten til å produsere Paenan. Genomet til ulike stammer blir sammenliknet ved bruk av verktøyene BLAST, RAST og BRIG.

Slettingen av genene som kodet for glykosylhydrolaser, pepM og pepN, var vellykket. Eksopolysakkarider produsert fra disse stammene ga kortere fibre sammenliknet med villtypen. Dette kan tyde på at glykosylhydrolaser spiller en viktig rolle i biosyntesen av Paenan. Mulige roller kan være innen prosesseringen av polysakkarider for eksport eller å fungere som en sikkerhet hvis eksporten mislykkes. Utbyttingen av pepF ble forsøkt utført, man var ikke vellykket. Sammenlikningen av Paenan-klusteret viste høy likhet mellom de ulike stammene av Paenibacillus, noe som indikerer at Paenan også kan bli produsert av andre stammer.

Many bacteria have the ability to produce exopolysaccharides. These polysaccharides have important functions for the cell, but have also shown promising properties for industrial utilization. There are many different types of polysaccharides, and their diverse chemistry yields polysaccharides with different functions and thus putative novel applications. In addition, the use of genetic engineering can increase the production yields and give the possibility to create tailor-made polysaccharides. Paenibacillus polymyxa is able to produce an exopolysaccharide called Paenan, which holds many interesting properties and can give rise to several novel applications for the industry. A CRISPR-Cas9 plasmid called pCasPP has been constructed for targeted genetic modifications of P. polymyxa, and has been used to get a better understanding of the Paenan biosynthetic pathway.

In this study, CRISPR-Cas9 is used for two gene deletions and one gene replacement. The two genes, pepM and pepN, which encode glycosyl hydrolases in the Paenan cluster are deleted. The produced exopolysaccharides from the two deletion-strains are then compared to the wildtype. The aim of the gene replacement is to replace the pepF gene, which encodes a glycosyl transferase, with another glycosyl transferase from Xanthomonas campestris. This may give an indication on how the chemical structure can be modified. The possibility of other Paenibacillus strains to produce Paenan is also investigated by genome comparison. This is conducted using the tools BLAST, RAST and BRIG.

Finally, the pepM and pepN genes were successfully deleted. The produced exopolysaccharides from these two strains gave shorter fibres compared to the wildtype. This may indicate that glycosyl hydrolases play an important role in the biosynthesis, and possibly are involved in processing the polysaccharide for export or to function as a failsafe enzyme when the export fails. The gene replacement of pepF was attempted, but was not successful. The genome comparison of the Paenan cluster showed high similarity between several Paenibacillus strains, and indicates that Paenan can be produced by other strains.