Cell Wall Biomineralization in the Centric Diatom Thalassiosira pseudonana: Investigation of the Putative Role of Silicanin Tp23191 and the Impact of Microfilaments and Microtubules

Abstract

Kiselalgar inkorporerar kiseldioksid, betre kjent som silika (SiO2), i celleveggen, frustulen, i eit karakteristisk og artspesifikt mønster. Denne silika-strukturen er av høg styrke, og nettopp difor er det fordelaktig å nytte kiselalgar for høgskala-produksjon av mønsterforma silika. Trass i at mange organiske komponentar som protein, langkjeda polyamin og rammestrukturar slik som cytoskjelettet er kjende for å delta i danninga av biosilika er prosessen i si heilheit lite kjent. Målet med denne oppgåva var å få eit innblikk i korleis biosilika vert danna i kiselalgar, potensiell bruk av frustular i bioteknologiske applikasjonar, og å undersøke den antekne assosiasjonen mellom silikaniner, element i cytoskjelettet, og danning av frustular. For å oppnå dette vart det gjennomført to literaturstudier og eksperimentell forskning. Litteraturstudia gav ei oversikt over dei vanlege morfologiske trekka hos kiselalgar, korleis framstilling av frustular er relatert til cellesyklusen i kiselalgar, og eit innblikk i potensiell framtidig bruk av frustular i medikamementell behandling og immundiagnostikk.

Den anteke assosiasjonen mellom silikanin Tp23191, danning av frustular og korleis mikrofilamenter og mikrotubuli bidreg til frustulemorfologi vart undersøkt eksperimentelt. Tp23191 tilhøyrer den nyleg oppdaga proteinfamilien silikaniner som er anteke å vere kopla til silikalemma, membranen rundt Silika Deponerings Vesiklar (SDVar). Før oppstart av denne masteroppgåva vart fusjonsproteinet mNeonGreen(mNG)-Tp23191 under same promotor som det opprinnlege genet konstruert av forfattaren og transformert inn i Thalassiosira pseudonana. Fusjonsproteinet vart lokalisert i celler frå transgene linjer som samsvarte med valve og girdle band SDVar, og resultat frå eit synkroniseringsstudie indikerte at mNG-Tp23191 er høgst uttrykt i fase G2+M i cellesyklusen, der valves er danna i valve SDVar.

I denne oppgåva vart trangene linjer av T. pseudonana vellykka synkronisert i vekst, og tal celler i dei ulike fasane blei kalkulert. Studiet av mNG-Tp23191 i transgene linjer innebar intracellulær lokalisering med mikroskopiering, immunodeteksjon av mNG med western blot og deteksjon av fluorescens signal frå mNG med flowcytometri. Ein uventa reduksjon i ekspresjonsnivå av mNG-Tp23191 i transgene linjer av T. Pseudonana førte til at studia ikkje gav resultat. Det er anteke at ei undertrykking av genekspresjon var grunnen til endringa, og eksperimenta burde gjentakast. Kulturar med T. pseudonana var individuelt behandla med cytochalasin D som hindrar polymerisering av mikrofilamenter, og colchicine og oryzalin som hindrar vekst av mikrotubuli. Ved bruk av skanningelektronmikroskop vart frustular avbilda. Basert på observerte morfologiske endringar, er det rimeleg å konkludere med at mikrofilamenter og mikrotubuli påverkar danninga av frustular i T. pseudonana, men at den spesifikke rolla framleis er ukjent. Kort oppsummert så er kunnskapen om danninga av biosilika mangelfull, og ytterlegare karakterisering av mellomprodukt og detaljert forståing av molekylære mekanismar involvert i danning av frustular vil vere fordelaktig for den framtidige utviklinga av kiselalge-baserte applikasjonar.

Diatoms incorporate amorphous silica (SiO2) into the cell wall, the frustule, in a characteristic species-specific pattern. The silica structure is of high strength. Hence, the diatoms are suitable for high scale production of nanopatterned silica. While many organic components like proteins, long-chain polyamines, and scaffold structures such as the cytoskeleton play a role in biosilica formation, the process as a whole is poorly understood. The purpose of this thesis was to get an overview of biosilica creation in diatoms, the potential use of diatom frustules in biotechnological applications, and investigate the putative association between silicanins, elements of the cytoskeleton, and frustule assembly. This was achieved by conducting two literature studies and laboratory research. The literature studies gave an overview of the common morphological features of diatoms, how frustule assembly is related to the cell cycle, and an insight into the potential of diatom frustules in drug delivery systems and immunodiagnostics.

The putative association between silicanin Tp23191 and frustule assembly, and how microfilaments and microtubules contribute to frustule morphology were investigated with laboratory research. Tp23191 is a member of the newly discovered silicanin family, which is predicted to be silicalemma-spanning proteins. Before this thesis, the fusion protein mNeonGreen (mNG)-Tp23191 under a native promotor was created by the author and transformed into Thalassiosira pseudonana. Examination of transgenic lines localized the fusion protein in regions consistent with the cell wall, and valve and girdle band Silica Deposition Vesicles (SDVs). Additionally, the results from a synchronization study led to the assumption that the highest expression of mNG-Tp23191 is in the G2+M phase of the cell cycle, where valves are created in valve SDVs.

In this thesis, transgenic lines of T. pseudonana were successfully synchronized in growth, and cell cycle stages were determined. Study of mNG-Tp23191 fusion protein involved intracellular localization with microscopy, immunodetection of mNG with western blot, and detection of fluorescence signal within the range of mNG with flow cytometry. However, all functional studies were inconclusive because of the unexpected reduction in the expression level of mNG-Tp23191 in transgenic lines of T. pseudonana. It is assumed that the change was due to gene silencing, and the experiments should be repeated. T. pseudonana cultures were separately treated with the microfilament inhibitor cytochalasin D and the microtubule inhibitors colchicine and oryzalin. Observations of morphological changes in frustules examined by scanning electron microscopy indicated the involvement of microfilaments and microtubules in the formation of frustules in T. pseudonana, but their specific contribution to frustule assembly is not confirmed. Overall, the knowledge of biosilica creation is fragmented, and further characterization of intermediates, as well as a detailed description of molecular mechanisms involved in frustule assembly, are advantageous for the future development of diatom-based applications.