Investigating fluorescence in transformants expressing a silicanin-mNeonGreen fusion protein, and the effect of cytoskeleton inhibitors on frustule biosynthesis in the diatom Thalassiosira pseudonana

Abstract

Kiselalger er utbredte mikroorganismer som har unike cellevegger laget av silika kalt frustuler. Disse frustulene har intrikate, artsspesifikke mønstre, og er spesielt kjente for at de har en høy spesifikk styrke. Ved å forstå frustuleformasjonen i kiselalger er det antatt at man skal kunne få viktig informasjon om hvordan materialer med de samme kvalitetene kan syntetiseres, som videre kan brukes i nanoteknologiske applikasjoner. En tidligere avhandling produserte transformanter av fusjonsgenet mNeonGreen-Tp24711 i Thalassiosira pseudonana for å studere lokasjon og ekspresjon av silikaninet Tp24711, men etter avhandlingen sluttet cellene å uttrykke genet. Denne studien har som mål å finne ut hva som skjedde med transformantene, i tillegg til å undersøke hvilken effekt cytoskjelettinhibitorer har på frustulens morfologi i T. pseudonana. Videre tar avhandlingen et helhetlig blikk på proteiner og organiske molekyler som er involvert i frustulesyntesen i kiselalger i form av et litteraturstudie. Cellene som sluttet å uttrykke fluorescens ble studert gjennom mikroskopi, flowcytometri og western blotting, der alle metodene indikerte at cellene ikke uttrykte mNeonGreen. En PCR-reaksjon ble kjørt for å undersøke om noe hadde skjedd med det transformerte plasmidet, men det var ikke mulig å trekke slutninger rundt resultatet. Ved enden av studien ble algene studert på nytt i fluorescens- og konfokalmikroskop, og da uttrykte de mNeonGreen-fluorescens igjen. Etter tilsats av cytoskjelettinhibitorer til kiselalgekulturer ble frustulene observert i et skanningelektronmikroskop. Frustulene som var behandlet med microtubulus-inhibitorer (colchicine og oryzalin) hadde uorganisert vekst av ribber og krysslinker, samtidig som noen nesten ikke hadde vekst av ribber og krysslinker. Flere av frustulene hadde et uregelmessig antall fultoportulae. Frustulene som var påvirket av en mikrofilament-inhibitor (cytochalasin D) hadde ikke ribber og krysslinker som vokste ut fra valven, og de manglet en fultoportula.

Diatoms are ubiquitous microorganisms that have unique cell walls made from silica called frustules. These frustules have intricate species-specific patterns, and are known for their high specific strength. By understanding the formation of the frustule, it is believed that one can gain precious information about how to make materials with the same qualities, which can be utilised in nanotechnological applications. A previous thesis made fluorescent mNeonGreen-Tp24711 fusion gene transformants of Thalassiosira pseudonana in order to study the location and expression of the silicanin Tp24711, however, the cells stopped expressing the gene afterwards. This study aims to understand what happened to the transformants, in addition to investigating how cytoskeleton inhibitors affect valve morphology in T. pseudonana. Furthermore, the thesis takes a comprehensive look on existing research on proteins and organic molecules that are involved in frustule synthesis in diatoms, through a literature study. The transformants that stopped expressing fluorescence were studied through microscopy, flow cytometry and western blotting, all of which indicated no expression of mNeonGreen. A PCR was run in order to see if something had happened to the sequence on the plasmid, but the results were inconclusive. At the end of the thesis the transformants were reobserved using fluorescence and confocal microscopy, which showed that they had regained their mNeonGreen fluorescence. After addition of cytoskeleton inhibitors to cultures of \textit{T. pseudonana} the frustules were observed using Scanning Electron Microscopy. Several of the frustules treated with microtubule inhibitors (colchicine and oryzalin) showed a disordered growth of ribs and cross-links, while several others had almost no growth of ribs and cross-links. The frustules also had irregular numbers of fultoportulae. The frustules that were grown with addition of a microfilament inhibitor (cytochalasin D) lacked protruding ribs and cross-links, and they were missing a fultoportula.