| dc.description.abstract | Ekstracellulære polysakkarider (EPS) er bakterielle polysakkarider som skilles ut av cellen. Ulike typer bakterier syntetiserer EPS med strukturelle og funksjonelle forskjeller. Dette resulterer i at de har varierte industrielle viktige egenskaper, som gjør at de kan bli brukt som emulgerende, viskosifiserende, fortykkende, stabiliserende eller innkapslende midler. Imidlertid er det kun noen få bakterielle EPS som har nådd kommersialisering og brukes i industrien. Dette har vekket stor interesse for å utvikle nye mikrobielle EPS med forbedrede, nye og målrettede egenskaper ved hjelp av kjemiske eller genteknologiske metoder. For genetisk konstruerte polysakkaridstrukturer er det viktig at også polymerisasjons- og eksportsystemet i bakteriene er funksjonelle for den modifiserte strukturen. De fleste EPS syntetiseres via den Wzx/Wzy-avhengige biosynteseveien, hvor den lipid-lenkede repeterende enheten er satt sammen i cytoplasma etterfulgt av translokasjon til periplasma utført av Wzx-flippasen. Deretter utføres polymerisasjonen av Wzy-polymerasen, og biopolymeren transporteres ut av cellen ved hjelp av ytterligere transportproteiner. Det er liten kunnskap om strukturen, mekanismen, funksjonaliteten, substratpreferansen og spesifisiteten til disse viktige Wzx og Wzy transmembranproteinene. Det er derfor av stor interesse og nødvendighet å få en mer detaljert evaluering av disse proteinene for å kunne produsere skreddersydde EPS.
Målet med denne masteroppgaven var derfor å få bedre kunnskap om funksjonaliteten og spesifisiteten til Wzx og Wzy proteiner fra forskjellige bakterier som er involvert i biosyntesen av nært beslektede EPS strukturer. For dette ble genene gumJ (Wzx) og gumE (Wzy) fra Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) slettet, og funksjonaliteten til de heterologe genene fra Komagataeibacter sucrofermentans og Kozakia baliensis ble analysert. Sletting av gener ble utført ved bruk av et sacB-basert selvmordsplasmid i to forskjellige X. campestris-stammer, etterfulgt av ekspresjon av de heterologe Wzx- og Wzy-kodede genene fra et IPTG-indusert ekspresjonsplasmid. Disse plasmidene ble vellykket konstruert via Gibson Assembly. Funksjonaliteten og evnen til de heterologe Wzx og Wzy proteinene til å gjenkjenne de repeterende enhetene av xanthan som substrat ble evaluert, og ved å gjenopprette xanthan-produksjonen ble det resulterende EPS analysert og karakterisert. I tillegg ble det foretatt en sammenligning av wzx og wzy genene på nukleotid- og aminosyresekvensnivå ved bruk av forskjellige bioinformatiske verktøy.
Til slutt ble en vellykket sletting av wzx genet oppnådd i Xcc∆gumD. Denne stammen har en ytterligere sletting av den første glykosyltransferasen, GumD, og er dermed ikke i stand til å produsere xantan. Vellykket reetablering av xanthan-biosyntesen ble realisert ved å uttrykke det originale gumD genet fra X. campestris og det heterologe wzx genet fra K. baliensis. Følgelig ble det vist at Wzx proteinet fra K. baliensis er funksjonell i translokasjon av den repeterende enheten av xanthan, mens Wzx proteinet fra K. sucrofermentans ikke er det. På den annen side ble det ikke oppnådd noen vellykket sletting av wzy genet. Dødeligheten til sletting av genene wzx og wzy i villtype-stammen av X. campestris ble indikert ved observert omorganisering av genomet eller ingen oppnåelse av kloner etter slettingene. Videre ble effekten av å uttrykke de naturlige og heterologe genene samtidig, henholdsvis kromosomalt og episomalt, utført for å analysere effekten det hadde på xantan biosyntese og produktivitet. Til slutt ble de oppnådde polysakkaridene reologisk karakterisert og monomersammensetningen ble analysert. Alle de oppnådde biopolymerene hadde de samme egenskapene og sammensetningen som xanthan, og viser dermed suksessen til denne fremgangsmåten. | |
| dc.description.abstract | Extracellular polysaccharides (EPS) are bacterial polysaccharides that are secreted into the environment. Different type of bacteria synthesizes structurally and functionally diverse EPS. This results in various properties of industrial importance, such as emulsifying, viscosifying, thickening, gelling, stabilizing or encapsulating agents. However, only a few bacterial EPS have reached commercialization and are used in industry. This has raised a big interest in developing new microbial EPS with improved, novel and targeted properties by chemical or genetic engineering. For genetically engineered polysaccharide structures, it is essential that also the polymerization and export system in the bacteria is functional for the modified structure. Most EPS of commercial interest are synthesized via the Wzx/Wzy-dependent biosynthesis pathway, where the lipid-linked repeating unit is assembled in the cytoplasm followed by translocation into the periplasm by the Wzx flippase protein. Next, polymerization is performed by the Wzy polymerase, and the polymer is transported out of the cell by the action of additional transporter proteins. There is little knowledge about the structure, mechanism, functionality, substrate preference and specificity of these important Wzx and Wzy integral membrane proteins. It is therefore of highest interest and necessity to have a more detailed evaluation of these proteins to be able to produce tailor-made EPS.
Therefore, the aim of this thesis was to obtain a better knowledge of the functionality and specificity of the Wzx and Wzy proteins from different bacteria which are involved in the biosynthesis of closely related EPS structures. For this, the genes gumJ (Wzx) and gumE (Wzy), of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) were targeted for deletion, and the functionality of the heterologous genes from Komagataeibacter sucrofermentans and Kozakia baliensis was analyzed. Gene deletions were performed by use of a sacB-based suicide plasmid in two different X. campestris strains, followed by expression of the heterologous Wzx and Wzy encoding genes from an IPTG-induced expression plasmid. These plasmids were successfully constructed via Gibson Assembly. The functionality and ability of the heterologous Wzx and Wzy proteins to recognize the repeating units of xanthan as substrate were evaluated, and by restoring the xanthan production, the resulting EPS were analyzed and characterized. Additionally, a comparison of the wzx and wzy genes on nucleotide- and amino acid sequence levels, as well as protein modeling, was conducted by the use of different bioinformatic tools.
Finally, a successful deletion of the wzx gene was obtained in Xcc∆gumD. This strain has an additional deletion of the initial glycosyltransferase GumD, and is thus unable to produce xanthan. Successful re-establishment of the xanthan biosynthesis was realized by expression of the native gumD gene and the heterologous wzx gene from K. baliensis simultaneously. By that, it was shown that the Wzx protein from K. baliensis is functional in translocation of the repeating unit of xanthan, whereas the Wzx protein from K. sucrofermentans is not. Furthermore, no successful deletion of the wzy gene was obtained. The lethality of wzx and wzy deletions in the wild-type strain of X. campestris was indicated by observed genome rearrangements or by obtaining no clones after the deletions. Moreover, the effect of simultaneous expression of the native as well as heterologous genes, chromosomal and episomal, respectively, was performed to analyze the effect on xanthan biosynthesis and productivity. Finally, the polysaccharides obtained from the different approaches were rheologically characterized and the monomer composition was analyzed. All biopolymers obtained by the different approaches have the same characteristics and composition as xanthan, showing the success of this approach. | |