Modified xanthan structure by expression of heterologous glycosyltransferases in a gumI deletion strain and initial polysaccharide characterization

Abstract

Xanthan er en mikrobiell eksopolysakkarid (EPS) med en pentasakkarid repeterende enhet med en ryggrad av β-D-glukose-(1→4)-β-D-glukose med en sidekjede besteående av β-D-mannose-(1→4)-β-D-glukuronsyre-(1→2)-α-D-mannose. Xanthan blir produsert av den Gram-negative bakterien Xanthmonoas campestris gjennom Wzx/Wzy-synteseveien. I denne reaksjonsveien vil glykosyltransferaser bygge opp den repeterende enheten av EPSen i cytoplasma før polymeriseringen gjennomføres i periplasma. Prosjektering av skreddersydde varianter av biopolymerer er et lovende felt for både medisinske og industrielle anvendelser, og dermed har det nylig blitt et skarpt fokus på å lage skreddersydde polysakkarider. Målet med skreddersydde biopolymerer er å endre strukturen for å designe en biopolymer med kvaliteter og egenskaper som er ønskelig for en gitt anvendelse. For å oppnå dette er det behov for flere studier på forholdet mellom struktur og funksjon hos polysakkarider, i tillegg til ytterligere karakterisering av biosynteseklynger fra EPS-produsenter, og spesielt mekanismen til ulike glykosyltransferaser. For å vurdere bidraget fra hver karbohydratmonomer, bør det utføres grundige reologiske karakteriseringer for polysakkarid-varianter der det er tilsatt eller fjernet en enkelt monomer. I denne masteroppgaven blir heterologe glykosyltransferaser fra Kozakia baliensis og Komagataeibacter sucrofermentas uttrykt i en gumI knockout-stamme av X. campestris LMG 8031 som manlger glykosyltransferasen GumI som er ansvarlig for å feste den ytterse mannosen på sidekjeden. Polymerene laget ved hjelp av plasmidbasert ekspresjon ble opprinnelig karakterisert og sammenlignet med opprinnelig xantan. Ekspresjonsplasmidene ble designet med Gibson Assembly, og den innledende karakteriseringen inkluderer evaluering av vekstkarakteristika, NMR-analyse, SEC-MALLS, analyse av monomersammensetning via HPLC-MS og viskositetsmålinger. Den generelle funksjonaliteten til ekspresjonsplasmidet ble bevist ved å uttrykke det opprinnelige gumI-genet i knockout-stammen og gjenopprette pentasakkaridstrukturen til villtype xanthan. Ekspresjon av gt1 fra K. baliensis ble vist å katalysere overføringen av en galaktosemonomer til β-D-glukuronsyre på sidekjeden til xanthan-varianten, i stedet for mannose-monomeren som i den opprinnelig xanthan-strukturen. Denne xantan-varianten viste en høyere stabilitet ved påført skjærspenning. Den modifiserte biosyntesen resulterte i et redusert utbytte av polysakkarid som kan knyttes til spesifisiteten til flippasen i Wzx/Wzy-synteseveien eller en metabolsk belastning fra ekspresjonsplasmidet. Genet aceQ fra K. sucrofermentas er beskrevet for å overføre en β-D-glukose til en β-D-glukuronsyre. Men da genet ble uttrykt i X. campestris knockout-stammen katalyserte det ikke denne reaksjonen. De ikke-karakteriserte glykosyltransferasene gt2 og gt5 fra K. baliensis katalyserte ikke overføringen av en monomer til β-D-glukuronsyre på den avkortede xantan-repeterende enheten. Imidlertidig ga ekspresjon av gt5 en økning i viskositeten, i tillegg til en gel-lignende karakter i den resulterende polymer. Ved dette vises plasmidbasert ekspresjon av fremmede glykosyltransferaser i utvalgte knockout-stammer seg som en enkel metode med et stort potensiale for utforming av nye polysakkarider, så vel som analysen av ikke-karakteriserte glykosyltransferaser. For glykosyltransferaser som resulterer i målrettede modifikasjoner, er en fremtidig tilnærming å integrere de i kromosomet til knockout-stammer for å redusere den metabolske belastningen av ekspresjonsplasmidet.

Xanthan is a microbial exopolysaccharide (EPS) with a pentasaccharide repeating unit consisting of a β-D-glucose-(1→4)-β-D-glucose backbone and a side-chain of β-D-mannose-(1→4)-β-D-glucuronic acid-(1→2)-α-D-mannose where the α-D-mannose is bound to the glucose backbone. The EPS is produced by the Gram-negative bacteria Xanthomonas campestris through the Wzx/Wzy dependent pathway. In this pathway, glycosyltransferases (GTs) assemble the repeating unit of the EPS in the cytoplasm prior to polymerisation in the periplasm. The engineering of tailor-made variants of biopolymers is a promising field for both medical and industrial applications, and thus there has recently been a sharp focus on creating tailor-made polysaccharides. The aim of tailor-made biopolymers is to alter the structure to design a biopolymer with properties and characteristics that are desirable for a given application. To accomplish this, there is the need for more studies on the structure-function relationship of polysaccharides, in addition to further characterisation of biosynthesis gene clusters of EPS producers and especially the mechanisms of the GTs. To assess the contribution of each carbohydrate monomer, in-depth rheological characterisations should be conducted for polysaccharide variants with addition or removal of a single monomer. In this study, foreign GTs from Kozakia baliensis and Komagataeibacter sucrofermentas are expressed in a X. campestris LMG 8031 deletion strain which lacks the GumI glycosyltrasnferase, responsible for adding the terminal mannose in the side chain. The polymers obtained by the plasmid-based expression were initially characterised and compared to the wild-type xanthan. The expression plasmids were designed via Gibson Assembly, and the initial characterisation and comparison include evaluation of growth characteristics, NMR analysis, SEC-MALLS, monomer composition analysis via HPLC-MS and viscosity measurements. The general functionality of the plasmid-based expression was proven to be functional by expressing the native gumI in the deletion strain and thus restoring the wild-type pentasaccharide structure of xanthan. Expression of gt1 from K. baliensis was shown to catalyse the transfer of a galactose monomer to the β-D-glucuronic acid on the side-chain of the xanthan variant, instead of the mannose monomer present in the native xanthan. This xanthan variant showed higher stability to applied shear stress. The modified biosynthesis resulted in a reduced polysaccharide yield which can be linked to the specificity of the flippase in the Wzx/Wzy pathway or a metabolic burden of the plasmid-based expression. The aceQ from K. sucrofermentas is described to transfer a β-D-glucose to a β-D-glucuronic acid. However, when expressed in the X. campestris deletion strain it did not catalyse this reaction. The uncharacterised GTs gt2 and gt5 of K. baliensis did not catalyse the transfer of any monomer to the β-D-glucuronic acid of the truncated xanthan repeating unit. However, expression of gt5 resulted in an increase of viscosity, in addition to a gel-like character of the polymer. By that, the plasmid-based expression of foreign GTs in selected deletion strain is shown as a straightforward method with a great potential for the design of novel polysaccharides as well as the analysis of uncharacterised GTs. For GTs which successfully perform targeted modifications, a future approach can be the chromosomal integration in the deletion strain to reduce the metabolic burden of the plasmid-based expression.