Development of a markerless tool for targeted deletion of chromosomal genes in the thermotolerant and methylotrophic bacterium Bacillus methanolicus

Abstract

Bakterien Bacillus methanolicus (B. methanolicus) utgjør en svært interessant kandidat innen industriell bioteknologi, i hovedsak grunnet dens termofile og metylotrofiske egenskaper, og for at den kan produsere høy-verdi forbindelser fra enkle ukonvensjonelle råstoffkilder. Bakteriens bruksområder er blant annet vist gjennom dets evne til å produsere relativt store mengder aminosyrer, og forbindelser som kadaverin, gamma-aminobutansyre, og acetoin ved metabolsk prosjektering. Videre innsikt i metabolismen til B. methanolicus og konstruksjon av genetisk stabile produksjonsstammer krever imidlertid utviklingen av nye genetiske verktøy, herunder et verktøy for genomredigering, som fortsatt ikke er blitt etablert i bakterien.

I dette studiet ble et genetisk verktøy for utførelse av markørløse gendelesjoner i det kromosomale DNA til B. methanolicus etablert, og delesjonen av to gener underbygget dets allsidigheten; upp kodende for uracil fosforibosyltransferase, og mtlD kodende for mannitol 1-fosfat 5-dehydrogenase. Den etablerte metoden baserer seg på introduksjonen av selvmordsvektoren pDELxp-oroP i B. methanolicus ved konjugasjon, etterfulgt av to homologe rekombinasjonshendelser. pDELxp-oroP ble konstruert til å inneholde en KanR seleksjonsmarkør, et oroP kontraseleksjonssystem, og klonede regioner oppstrøms og nedstrøms til genet som skal slettes. Den første rekombineringshendelsen finner sted mellom homologe regioner i den konjugerte selvmordsvektoren og det kromosomale DNAet, hvorpå seleksjonsmarkøren selekterer for integranter. Den andre rekombineringshendelsen finner sted intrakromosomalt mellom den integrerte vektoren og det kromosomal DNAet, og oroP kontraseleksjonssytemet selekterer for isolater der vektoren har blitt fjernet.

Delesjonene av upp og mtlD bekreftet spesifisiteten til det etablerte verktøyet, ettersom DNA sekvensering viste en sømløs fjerning av de to genene. Karakteriseringer av de slettede genene på fysiologien til B. methanolicus ble undersøkt ved vekstforsøk på 5-fluorouracil (5-FU) og ved MtlD enzymanalyse, hvorpå de upp og mtlD kodede proteinene viste reduserte enzymaktiviteter. Gjenværende enzymaktivitet ble imidlertid også funnet, og indikerer tilstedeværelsen av andre enzymer med liknende katalytiske funksjoner. For delesjon av upp ble bioinformatikkverktøy derfor benyttet for å undersøke slike enzymer. Dessuten, komplementeringen av upp resulterte i en restaurert UPP fenotype og villtype vekstmønster, og bekreftet med det både delesjonen av upp og verktøyets spesifisitet for å kun medføre ønskede endringer i det kromosomale DNA.

Til slutt, ettersom dette arbeidet bidrar med et verktøy for å kunne utføre kromosomale gendelesjoner i B. methanolicus, bør videre studier avklare rollen til de foreslåtte overtakende enzymene til MtlD og UPP, og samtidig vurdere hvorvidt verktøyets allsidighet også er overførbart til andre gener. Dessuten, muligheten for å kunne gjøre målrettede kromosomale gendelesjoner bør også kunne fasilitere etableringen av produksjonsstammer av B. methanolicus med ønskede trekk i nær fremtiden.

The bacterium Bacillus methanolicus (B. methanolicus) serves as an exciting candidate within white biotechnology due to its thermophilic and methylotrophic traits, and for being able to produce value-added compounds from simple non-conventional feedstocks. Its applications have been shown by its ability to produce high yields of amino acids and the fact that it was metabolically engineered for the production of cadaverine, gamma-aminobutyric acid, and acetoin. However, further insights into the metabolism of B. methanolicus and the construction of genetically stable production hosts require an extended genetic toolbox, especially for genome editing, which has not yet been established for the bacterium.

In this work, a genetic tool for carrying out markerless gene disruptions in the chromosomal DNA of B. methanolicus was established. The deletion of two genes emphasized its versatility; upp encoding uracil phosphoribosyltransferase, and mtlD encoding mannitol 1-phosphate 5-dehydrogenase. The established method is based upon the transfer of the suicide vector pDELxp-oroP into B. methanolicus through conjugation, followed by two subsequent homologous recombination events. pDELxp-oroP was constructed to include a KanR selection marker, an oroP counterselection system, and cloned regions upstream and downstream to the targeted gene. The first recombination event occurs between the homology regions of the conjugated suicide vector and the chromosomal DNA, to where the selection marker serves to detect the integrants. The second recombination event occurs intrachromosomally between the homology regions of the integrated vector and the chromosomal DNA, whereby the oroP counterselection system selects for isolates where the vector has been cured.

The deletion of upp and mtlD confirmed the specificity of the established method, as the DNA sequencing data displayed a seamless knockout of both genes. Characterizations of upp and mtlD deletions on the physiology of B. methanolicus were assayed through growth experiments on 5-fluorouracil (5-FU) and MtlD enzyme assay, both of which indicated reduced enzyme activities of the upp and mtlD encoded proteins. However, some residual enzyme activities were also found, suggesting that alternative enzymes with similar catalytic functions are present. For the deletion of upp, bioinformatics tools were used to investigate such alternative enzymes. Moreover, the complementation of upp resulted in a restored UPP phenotype and wild-type growth pattern, ultimately confirming its deletion and the tool's specificity only to alter the targeted region in the chromosomal DNA.

To conclude, as this work provides a tool for chromosomal gene deletions in B. methanolicus, further studies should be able to clarify the roles of the proposed overtaking enzymes and whether the tool's versatility is reflected by the deletion of other genes. Besides, the possibility of making targeted chromosomal deletions should facilitate the future establishment of production strains with desired traits of B. methanolicus.