Elucidating the Impact of Various Physiological Conditions on Persister Cell Formation in Escherichia coli

Abstract

I løpet av dei siste tiåra har det vore ei stagnering i antibiotikautvikling samstundes som det har vore ei auking i førekomsten av antibiotikaresistens. Det er difor av stor interesse å få ei djupare forståing av dei underliggjande mekanismane som kan forklare korleis mikroorganismar overlev i dødelege miljø. Ved antibiotikabehandling kan bakteriens metabolske tilstand påverke det fenotypiske utfallet. Bakteriar kan overleve antibiotikabehandling gjennom tre hovudtilpassingar: toleranse, resistens og persistens. Persistens er ei flyktig fenotype som er vist å vere involvert i kroniske sjukdommar. Denne fenotypen er i tillegg vist å bli delvis indusert av stressresponsgenet relA. Til tross for dette, er dei underliggjande mekanismane for persisterutvikling fortsatt omdiskutert. I denne masteromhandlinga karakteriserer eg persistere og undersøkjer samstundes korleis denne fenotypen vert selektert for ved ulike fysiologiske tilstandar. Dette vart utført ved bruk av persistertestar på Escherichia coli. I tillegg optimaliserer eg prøveuttakingsprosedyren for E. coli celler til metabolomanalyse. Metabolomanalyse av 64 metabolittar ved forskjellige vekstfasar for både vildtype og ΔrelA mutant vart undersøkt ved bruk av kromatografi og massespektrometri. Resultata blei brukt til å evaluere metabolske tilpassingar som kan være involvert i utviklinga av persisterceller. Persistertestar er robuste for a kvantifisere persistermengder. Persistere vert karakterisert ved bifasiske drapskurver samt fenotypisk byting. Få studiar har evaluert rolla mediet i persistertesten har å seie for persisterutvikling. Her rapporterer eg at dette mediet, samt typen antibiotika brukt, har stor påverknad på persistermengda. Det blei også observert fleire persistere frå stasjonærfase enn eksponentiell fase, noko som delvis skuldast uttrykk av genet relA. I stasjonærfase skjedde det ein nedgang i cellas energiladning. I tillegg endra mengde av intracellulære metabolittar seg. Desse tilpassingane hypoteserar eg er pådrivarar for persisterdanning. Prøveuttakingsoptimaliseringa viste at varm vaskeløysing gav høgare aminosyrekonsentrasjon enn kald vaskeløysing. I tillegg var filtrasjonstida og energiladninga til cella invers korrelerte. Filtrasjonstid og vasketemperatur er difor kritiske parameter å ta i betraktning når ein skal ta ut bakterieprøvar for metabolomanalyse. Denne masteromhandlinga vil bidra i å utvikle standardiserte protokollar samt stille interessant hypotetiske spørsmål kring dei underliggjande molekylære mekanismane for persisterutvikling i E. coli.

The last decades have seen a stagnation in antibiotic development concurrently with increased incidents of antibiotic resistance. It is therefore of great importance to obtain a further understanding of the underlying mechanisms that facilitate microbial survival in lethal conditions. The metabolic state of the cell can influence the phenotypic outcome of bacteria in response to antibiotic treatment. Bacteria can survive antibiotic treatments through formation of three main phenotypes: tolerance, resistance and persistence. Persistence is a transient phenotype that is reported to be involved in recalcitrant and chronic infections. Moreover, this phenotype is thought to be partly induced by the stringent response gene relA. However, the complete underlying mechanisms for persister formation remains elusive. In this thesis, I explore characteristics of the persister phenotype. In addition, I evaluate how this phenotype is selected for at different physiological conditions using persister assays on Escherichia coli. I further optimize the sampling procedure of E. coli cells for endometabolome analysis. Endometabolome analysis of 64 metabolites at different growth phases for E. coli WT and ΔrelA mutant was investigated using chromatography coupled mass spectrometry. The results were used to evaluate metabolic alterations that might be involved in persister cell formation. Persister assays are reliable tools for quantification of persister levels. This is evident by biphasic killing kinetics and phenotypic switching which are hallmarks of persisters. However, few studies have elucidated the impact of the persister assay media used. Here, I report that this media, in addition to the antibiotic used, considerably affects the selection of persister cells. Furthermore, stationary phase cells induce elevated levels of persisters relative to exponential phase through triggered responses, partly mediated by RelA. At stationary phase there was a drop in the adenylate energy charge, in addition to altered intracellular metabolic pools. I hypothesize these adaptations to be contributory factors for persister formation. Evaluation of the endometabolome sampling protocol demonstrated that warm washing solution yielded higher amino acid concentrations than cold. Moreover, filtration time and adenylate energy charge were inversely correlated. Hence, warm washing solution in addition to low filtration time are crucial parameters for optimizing the sample protocol. This thesis may contribute in the development of standardized protocols and rise interesting hypothetical questions regarding the underlying molecular mechanisms of persister cell formation in E. coli.