Establishment and validation of the XylS/Pm regulator/promoter system in Streptomyces lividans ΔmatAB for expression and secretion of Lytic Polysaccharide Monooxygenase

Abstract

Den første generasjonen av biodrivstoff, introdusert som et miljøvennlig alternativ til fossile drivstoff, var laget av matavlinger som er en suboptimal løsning med en verdenspopulasjon som stadig utvider seg slik at matbehovet øker. Som en løsning ble en ny andre-generasjon av biodrivstoff introdusert. Drivstoffet ble da laget ved konvertering av alternative biomasser som lignocellulosiske materialer. Nedbrytningen av robuste lignocellulosiske materialer for biodrivstoffproduksjon er dog vanskelig, men oppdagelsen av lytisk polysakkarid monooksigenaser (LPMOer) snudde om på situasjonen. LPMOer er enzymer som fasiliterer tradisjonelle enzymer i biokjemisk nedbryting av lignocellulose. Derfor har LPMOer et enormt potensial. Utviklingen av effektive plattformer for rekombinant LPMO-produksjon er derfor essensielt for å gi biodrivstoffproduserende næringer store mengder av dette nøkkelenzymet. Per dags dato er Escherichia coli den mest utnyttede verten for rekombinant proteinproduksjon, grunnet dens fordeler ved kultivering og fleksibilitet innen genetisk manipulering. Til tross for mange gunstige egenskaper, er ulemper som aggregering til uløselige inclusion bodies eller ufullstendig posttranslasjonelle modifikasjoner uunngåelig for visse proteiner eller enzymer produsert i E. coli. På grunn av dette er alternative bakterielle verter for rekombinant proteinproduksjon ønskelige. Streptomyces lividans 1326 ΔmatAB, en mutantstamme med raskere og gunstigere vekst enn dens villtype, ble i dette arbeidet evaluert som en potensiell vert for rekombinant produksjon av en LPMO kjent som CelS2. Målet var å etablere og evaluere ekspresjonsvektorer med og uten XylS/Pm regulator/promotor-systemet i S. lividans ΔmatAB for rekombinant CelS2-produksjon. Rekombinant CelS2-produksjon og sekresjon var den tiltenkte anvendelsen for ekspresjonsvektorene. Vekst- og ekspresjonsstudier ble gjort på S. lividans ΔmatAB, som demonstrerte raskere vekst og høyere celletetthet sammenlignet med villtypen. EGFP-ekspresjon ble også demonstrert å være høyere i ΔmatAB sammenlignet med villtypen, som gjør ΔmatAB en potensiell vert for CelS2-produksjon. XylS/Pm regulator/promotor-systemet ble også testet i ΔmatAB med pL97-EGFP-XylS/Pm and pL97-EGFP-XylS/Pm mod tipA. Deteksjon av rekombinant EGFP med Western Blot ble gjort i m-Toluat-induserte prøver, men EGFP-aktivitet var svakt indikert ved fluorescensmålinger av disse prøvene. XylS/Pm-baserte pLS- og PVB-vektorer med CelS2 med og uten en His-Tag ble også konstruert. CelS2 ble uttrykt fra vektorene i E. coli BL21 og BL21 (DE3) og evaluert med SDS PAGE. Målet videre var å evaluere muligheten for proteinrensing ved å bruke His-taggen og måle CelS2-aktivitet gjennom LPMO aktivitetsassayer. Slike målinger ble gjort for å etablere et referansenivå for CelS2’s oksiderende aktivitet. Assayet viste CelS2’s aktivitet som 0.017 ΔOD469nm /min og avslørte også høyere aktivitet når CelS2 ble erstattet med Cu2+-ioner. Det ble også avslørt en signifikant nedgang i aktivitet når CelS2 var oppbevart i kun en dag. Konstruksjon av pL99-SPsc-CelS2 H6 ble også gjort, og vektoren ble overført til og uttrykt i S. lividans ΔmatAB. Western Blot av CelS2 viste at det ble sekretert fullstendig ut i supernatanten til S. lividans ΔmatAB-kulturen. I dette arbeidet ble verken FPLC-rensing eller aktivitetstesting av CelS2 med og uten His-tag gjort på CelS2 uttrykt i BL21, BL21 (DE3) og ΔmatAB. Ekspresjon av EGFP fra pL97-EGFP-XylS/Pm mod nitA i ΔmatAB ble heller ikke testet.

The first-generation biofuels introduced as environmentally friendly substitutes to fossil fuels were made from food crops, which proved to be a suboptimal solution due to an expanding world population with an ever-rising demand for food. As a solution, a second generation of biofuels were introduced. Second generation biofuels are made by the conversion of alternative biomasses such as lignocellulosic materials. Breakdown of recalcitrant lignocellulosic material for biofuel production is challenging, but the discovery of Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMO) turned the table. LPMOs facilitate traditional enzymes’ bio-chemical breakdown of lignocellulose. Hence, LPMOs have a tremendous potential. Development of platforms for recombinant LPMO production is thus essential to provide biofuel producing industries with large quantities of this key enzyme. As of today, Escherichia coli is the most utilized host for recombinant protein production due to its cultivation advantages and flexibility in genetic manipulation. However, shortcomings such as aggregation of recombinant proteins into insoluble inclusion bodies or insufficient post-translational modifications are inevitable facts for certain proteins produced in E. coli. Because of this, alternative bacterial host species for recombinant protein production are desirable. Streptomyces lividans 1326 ΔmatAB is a mutant strain capable of faster and more favourable growth than its wild type. The mutant was in this work evaluated as a potential host for recombinant production of an LPMO known as CelS2. The aim was to establish and evaluate pL97- and pL99-based expression vectors with and without the XylS/Pm regulator/promoter system in S. lividans ΔmatAB. Recombinant CelS2 production and secretion was the intended application for these expression vectors. Growth and expression studies were conducted on S. lividans ΔmatAB, which demonstrated faster growth and higher cell densities compared to its wild type. Enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression was also demonstrated to be higher in ΔmatAB compared to the wt, making ΔmatAB a potential host for CelS2 production. The XylS/Pm regulator/promoter system was also tested in ΔmatAB harbouring pL97-EGFP-XylS/Pm and pL97-EGFP-XylS/Pm mod tipA. Detection of recombinant EGFP with Western Blot was done in m-Toluate-induced samples, but EGFP activity was poorly indicated by fluorescence measurements in these samples. XylS/Pm-based PLS and pVB vectors containing CelS2 with and without a His-Tag were also constructed. CelS2 was expressed from these in E. coli BL21 and BL21 (DE3) and evaluated by SDS PAGE. The goal was to further evaluate purification potential using the His-Tag and measure CelS2 activity through LPMO activity assays. Such measurements were conducted to establish a reference level of CelS2’s oxidizing activity. The assay displayed CelS2’s activity as 0.017 ΔOD469nm/min and the assay also revealed a higher activity when CelS2 was replaced with Cu2+ ions. It was also revealed a significant reduction in oxidizing activity when CelS2 was stored for only one day. Construction of pL99-SPsc-CelS2 H6 was also done, and the vector was transferred to and expressed in S. lividans ΔmatAB. Western Blot of CelS2 showed that it was completely secreted to the supernatant of the S. lividans ΔmatAB culture. In this work, purification and activity testing of CelS2 with and without His-Tag was not done for CelS2 expressed in BL21, BL21 (DE3) and ΔmatAB. Expression of EGFP from pL97-EGFP-XylS/Pm mod nitA in ΔmatAB was also not tested.