Protein extraction from the brown seaweed Saccharina latissima and Alaria esculenta - The effect of ultrasonication and enzymatic treatment

Abstract

Verdsomspennande matproduksjon møter no ei større utfordring enn nokon sinne. Aukande populasjon gjev auka etterspurnad etter mat, spesielt protein. Me må utvikle nye, berekraftige matforsyningar, som for eksempel akvatiske planter. Sjøgras kan ha relativt høgt proteininnhald og inneheld andre viktige næringsstoff, i tillegg til å ha eit lågt kaloriinnhald. Brunalgar har lågare proteininnhald samanlikna med raude og grøne artar, men dei er større, tilgjengelege i store mengder langs kysten, og kan enkelt dyrkast i Noreg. Dei veks ikkje djupt og kan derfor haustast enkelt, billig og raskt. Dette gjev brunalgar eit høgt potensial for storskala produksjon til bruk som mat og næringsstoff.

Trass i sine eigna karakteristikkar og høgt potensial for bruk i mat og fór, er makroalger framleis underutnytta ressursar. Dette er delvis grunna manglande kunnskap som gjev ein dårleg marknad og låg etterspurnad i Vesten. Utfordringar er også uønskte komponentar til stades i makroalger som gjer dei uønskeleg eller farlege å ete, i tillegg til låg biotilgjengelegheit av ønska næringsstoff. Begge desse problema kan ein overvinne ved å ekstrahere næringsstoff frå makroalgane, og det er derfor naudsynt å studere og forbetre spesifikke ekstraksjonsmetodar. Ekstraksjon assistert med ultralydbehandling og enzymhydrolyse kan gi effektiv degradering av biomasse med redusert forbruk av tid, løysemiddel og energi. Dette er meir berekraftig, økonomisk gunstig og reproduserbart samanlikna med konvensjonelle teknikkar.

Målet med denne masteravhandlinga var å undersøke proteinekstraksjon frå to brunalgeartar frå Norskekysten, Saccharina latissima og Alaria esculenta. Fokus var ulike metodar for forbehandling av makroalgane, og korleis dette påverkar proteinekstraksjon. Effekten av enkel og kombinert behandling ved ultralydbølger og enzym vart drøfta. Ultralydbølger vart brukt til å kollapse celleveggen for å frigjere innfanga protein, og deretter auke proteinekstraksjon. Enzyma Alginat lyase, Viscozyme L og Cellic CTec2 vart brukt til degradering av polysakkarid i celleveggen, og Alkalase skulle stå for proteolytisk nedbryting av peptidbindingar i protein. Proteinanalyse vart hovudsakleg gjort ved Lowry-metoden, men nokre prøvar vart også målt med CN-analyse og total aminosyreanalyse til samanlikning.

Resultat viser at enzym og sonikering aukar proteinekstraksjon i S. latissima og A. esculenta. Effektiviteten til proteinekstraksjon avhenger av mengdeforholdet mellom vatn og alge, innstillingar for sonikering, enzymkonsentrasjon, polyfenolinnhald i algane, tilstanden til biomassen (våt eller tørr), og graden av degradering før behandling. Også kombinasjonen av ulike behandlingar og behandlingsrekkjefølge er avgjerande. Det var signifikante forskjellar mellom gamal og ny S. latissima, med opp til 240 % auka utbytte frå proteinekstraksjon i det gamle partiet, grunna delvis degradert biomasse. Det var positiv korrelasjon mellom ekstraksjon av polyfenolar og protein i begge algar, men effekten var meir tydeleg i A. esculenta. Enzymkonsentrasjonane med best proteinutbytte for våt alge var 100 U/g (tørrvekt) Alginat lyase og 3 % (våtvekt) Cellic CTec2 for begge algeartar, og høvesvis 196 μl/g og 98 μl/g Viscozyme for S. latissima og A. esculenta.

Kombinert behandling frå enzym og sonikering gav auka utbytte i både våt og tørr alge. Sonikering etterfylgt av enzym såg ut til å vere den beste rekkjefølga for behandling, men dette var ikkje einrøystes for alle tilfelle. Tørr alge gav signifikant høgare utbytte enn våt alge for alle samanlikna behandlingar bortsett frå éi. For tørr alge gav sonikering kombinert med enzym auka proteinutbytte samanlikna med enzym og sonikering aleine, men forbetringa var ikkje alltid signifikant. Høgst proteinutbytte for tørr alge var frå behandling med US  Alginat lyase for S. latissima med 6.01 ± 0.03 % (tørrvekt) og US  Cellic CTec2 for A. esculenta med 5.59 ± 0.21 % (tørrvekt).

Sekvensiell enzymbehandling med Cellic og/eller Alkalase gav signifikant auke i proteinutbytte. Alkalase, aleine eller kombinert med Cellic CTec, gav signifikant høgre proteinutbytte samanlikna med Cellic CTec aleine. Høgst proteinutbytte var frå behandling av Alkalase for våt S. latissima med proteinutbytte på 11.75 ± 0.63 % (tørrvekt) og Cellic CTec + Alkalase for våt A. esculenta med utbytte på 6.05 ± 0.09 % (tørrvekt). Dette var behandlingane med høgst proteinutbytte blant alle eksperiment. Likevel såg Cellic CTec ut til å redusere størrelsen på proteina i større grad enn Alkalase. Aminosyreprofilane viste at alle målte aminosyrer er til stades i alle ekstrakt, og det er mest av aminosyrene alanin, glutaminsyre og aspartinsyre. Proteinutbytte varierer i forhold til analysemetoden som vert brukt. Lowry-analysen gav høgare utbytte enn CN- og total aminosyreanalyse. Det beste estimatet for proteinutbytte er antatt å vere ein mellomting mellom det som er målt frå dei tre metodane.

Utbytte ved ekstraksjon frå S. latissima var høgre enn for A. esculenta i alle eksperiment, med få unntak. Behandling med enzym var meir effektivt for S. latissima, mens ultralyd påverka A. esculenta i større grad. Totalt sett er ekstraksjon mest lovande frå biomasse som har fått påført kombinert behandling, enten ein kombinasjon av sonikering og enzym eller fleire enzym med ulik spesifisitet.

Worldwide food production is facing a greater challenge than ever before. The population growth increases the demand for food, especially proteins. We must develop new, sustainable food supplies, such as exploiting aquatic plants. Seaweed can have relatively high protein levels and contain other important nutrients, as well as having a low caloric content. Brown algae have a lower protein content compared to red and green species, but they are larger in size, available in high amounts along the coast and can be readily cultivated in Norway. They do not grow very deep and are therefore easy, cheap and fast to harvest. This gives brown algae a high potential for large-scale production for use as food and nutrients.

Despite their appealing characteristics and high potential for use in food and feed, macroalgae are under-exploited resources. This is partly due to lack of knowledge leading to a small market and low demand in the Western world. Challenges are also safety hazards present in macroalgae that might make them unpleasant or dangerous to consume, in addition to the low bioavailability of valuable seaweed nutrients. Both problems can be overcome when extracting nutrients from macroalgae, and there is therefore a need to study and improve specific extraction methods. Extraction assisted by ultrasonic treatment and enzymatic hydrolysis can give effective biomass degradation with reduced time, solvent, and energy consumption. This will be more sustainable, reproducible, and economically favourable than conventional techniques.

The objective of this thesis was to investigate protein extraction from two species of brown macroalgae from the Norwegian coast, Saccharina latissima and Alaria esculenta. The focus was different methods for pre-treatment of the macroalgal biomass and how this affects the protein extraction. The effects of independent and combined treatment by ultrasonic waves and enzymes was evaluated. Ultrasonic waves were used to collapse the cell wall matrix to release cavitated proteins and thereby increase the protein extraction. The enzymes Alginate lyase, Viscozyme L and Cellic CTec2 were used for degrading the cell wall polysaccharide matrix, and Alcalase was responsible for proteolytic breakdown of peptide bonds in proteins. The protein analysis was mainly done by the Lowry method, but some samples were also measured with CN and total amino acid analyses for comparison.

Results show that enzymes and sonication increase the protein extraction in S. latissima and A. esculenta. The efficiency of protein extraction depends on water to seaweed ratio, sonication settings, enzyme concentration, polyphenol content in the algae, state of the biomass (wet or dried), and extent of degradation prior to treatment. Also, the combination of different treatments and treatment order is crucial. There were significant differences between the old and new S. latissima, with up to 240 % increase in protein extraction yield in the old batch due to partly degraded biomass. There was a positive correlation between extracted polyphenols and protein for both algae, but with the most potent effect in A. esculenta. The enzyme concentrations giving the best protein yield for wet algae was 100 U/g (dw) Alginate lyase and 3 % (ww) Cellic CTec2 for both algal species, and respectively 196 μl/g and 98 μl/g Viscozyme for S. latissima and A. esculenta.

Combined treatment from enzymes and sonication improved protein yield for both wet and dry algae. Sonication followed by enzymes seemed to be the best treatment order, but this was not conclusive in all cases. Dry algae gave significantly higher yield than wet algae for all compared treatments except for one. For dry algae, sonication combined with enzymes increased protein yield compared to that of enzymes and sonication alone, although not always significantly. The highest protein yield for dry algae was from treatment with US --> Alginate lyase for S. latissima with 6.01 ± 0.03 % (dw) and US --> Cellic CTec2 for A. esculenta with 5.59 ± 0.21 % (dw).

Sequential enzymatic treatment with Cellic and/or Alcalase significantly increased protein yield. Alcalase, alone or in combination with Cellic CTec, gave a significantly higher protein yield compared to that of Cellic CTec alone. The highest protein yield was from treatment by Alcalase for wet S. latissima with a protein yield of 11.75 ± 0.63 % (dw) and Cellic CTec + Alcalase for wet A. esculenta with yield of 6.05 ± 0.09 % (dw). These were the treatments with the highest extraction yield for all experiments. However, Cellic seemed to reduce protein size more than Alcalase. Amino acid profiles showed that all measured amino acids are present in all extracts, and the most abundant amino acids are alanine, glutamic acid and aspartic acid. Protein yield varies according to the analytical method used. Lowry analysis provided higher yield than CN and total amino acid analysis. The most correct estimation of protein yield is thought to be something between what is recorded from the three methods.

Extraction yield from S. latissima was higher than that of A. esculenta in all experiments, with few exceptions. Enzymatic treatment was more efficient for S. latissima, while ultrasonication affected A. esculenta to a greater extent. The overall most promising extraction is seen for biomass with combined treatment, either a combination of sonication and enzymes or several enzymes of different specificity.