Metabolic engineering of B. methanolicus for production of 3-hydroxypropionic acid

Abstract

Bacillus methanolicus er en Gram-positiv, stavformet, metylotrof og termofil bakterie som kan vokse på metanol som eneste karbonkilde, noe som gjør den til en attraktiv vertsorganisme for mikrobiell produksjon av diverse kjemikalier. Formålet med denne avhandlingen var å konstruere B. methanolicus for produksjon av en slik kjemikalium, 3-hydroksypropionsyre (3-HP), oppført som en av de mest verdiskapende kjemikaliene produsert fra biomasse for å tilby et alternativ til eksisterende 3 -HP produksjon som bruker sukkerbaserte karbonkilder.

Den malonyl-CoA-avhengige banen for 3-HP-produksjon ble konstruert til B. methanolicus ved å tilsette det bi-funksjonelle MCR-enzymet fra Chloroflexus aurantiacus som omdanner malonyl-CoA til 3-HP via intermediatet malonat-semialdehyd. Dette ble gjort ved transformasjon av B. methanolicus med det konstruerte rekombinante plasmidet pBV2xp-mcrCa. En MCR-enzymanalyse ble utført for å undersøke 3-HP-produksjon av den nevnte stammen, der cellekulturer ble dyrket i minimale medier, gitt tid til å produsere MCR etter tilsetning av indusermolekylet xylose, høstet og brukt i en reaksjonsblanding der endringen i absorbansen ble målt i en periode før og etter tilsetningen av 3 mM malonyl-CoA. Ingen signifikant forskjell i absorptans ble observert, noe som tydet på at B. methanolicus + pBV2xp-mcrCa-stammen ikke produserte signifikante mengder 3-HP etter tilsetning av malonyl-CoA. Det ble gjort flere feilsøkings forsøk, men signifikant produksjon av 3-HP ble ikke oppnådd.

I tillegg til hoveddelen av prosjektet ble det utført en ribobryter-aktivitetsanalyse som undersøkte evnen til adeninbindende ribobryteren pbuE og dens syntetisk konstruerte variant pbuE10 for å tillate avstemelig genuttrykk i B. methanolicus. Super bretter grønt fluorescerende protein (sfGFP) ble brukt som reporterprotein, noe som muliggjorde evaluering av regulatoriske aktiviteter for ribobryter-konstruksjonene ved måling av fluorescens. To av konstruksjonene, pTH1mp-pbuE-sfGFP og pTH1mp-pbuE10-sfGFP, viste normaliserte fluorescensverdier etter tilsetningen av 1 mM av indusermolekylet 2-aminopurin på henholdsvis henholdsvis 2 500 og 7 000, og utgjorde omtrent 12,5% og 35 % av kontrollstammen pTH1mp-sfGFP. Bytting ut av mdh promoteren til fordel for Phxl økte ekspresjonsnivåene av sfGFP signifikant og resulterte i normaliserte fluorescensverdier på henholdsvis 26 000 og 46 000 for 2-AP induserte pTH1Phxl-pbuE10-sfGFP og pTH1Phxl-pbuE-sfGFP, og utgjorde omtrent 130 % og 260 % av kontrollstammen pTH1mp-sfGFP.

Bacillus methanolicus is a Gram-positive, rod shaped, methylotrophic and thermophilic bacterium capable of growing on methanol as the sole carbon source, making it an attractive host organism for microbial production of various chemicals. The aim of this thesis was to engineer B. methanolicus for production of one such chemical, 3-hydroxypropionic acid (3-HP), listed as one of the top value-added chemicals produced from biomass in order to provide an alternative to existing 3-HP fermentations which utilize sugar-based carbon sources.

The malonyl-CoA dependent pathway for 3-HP production was engineered into B. methanolicus by adding the bi-functional MCR enzyme from Chloroflexus aurantiacus capable of converting malonyl-CoA to 3-HP via the intermediate malonate semialdehyde. This was done by transformation of B. methanolicus with the constructed recombinant plasmid pBV2xp-mcrCa. An MCR enzyme assay was performed in order to examine 3-HP production by the aforementioned strain, in which cell cultures were cultivated in minimal media, given time to produce MCR after the addition of the inducer molecule xylose, harvested and used in a reaction mix, of which the change in absorbance was measured for a period of time prior to and after the addition of 3 mM malonyl-CoA. No significant change in absorbance was observed, indicating that the B. methanolicus + pBV2xp-mcrCa strain did not produce significant amounts of 3-HP after the addition of malonyl-CoA. Several troubleshooting attempts were made, however no significant 3-HP production was achieved.

In addition to the main part of the project, a riboswitch activity assay was performed, examining the ability of the adenine binding riboswitch pbuE and its synthetically engineered variant pbuE10 in allowing tunable gene expression in B. methanolicus. Super folder green fluorescent protein (sfGFP) was used as the reporter protein, allowing evaluation of regulatory activities of the riboswitch constructs by measurements of fluorescence. Two of the constructs, pTH1mp-pbuE-sfGFP and pTH1mp-pbuE10-sfGFP showed normalized fluorescence values after the addition of 1 mM of the inducer molecule 2-aminopurine of approximately 2 500 and 7 000, respectively, accounting for approximately 12.5 % and 35 % of that of the control strain pTH1mp-sfGFP. Exchanging the mdh promoter for Phxl significantly increased expression levels of sfGFP, resulting in normalized fluorescence values of approximately 26 000 and 46 000 for 2-AP induced pTH1Phxl-pbuE10-sfGFP and pTH1Phxl-pbuE-sfGFP, respectively, accounting for approximately 130 % and 260 % of that of the control strain pTH1mp-sfGFP.