| dc.description.abstract | Hypoksi defineres som en tilstand der oksygennivået er redusert sammenlignet med det fysiologiske nivået. Ondartede kreftsvulster har ofte hypoksiske områder, fordi deres ukontrollerte proliferering og mangelfulle vaskularisering tømmer omgivelsene for oksygen. Hypoksi er knyttet til aktivering av et komplekst signalnettverk som inkluderer masterregulatoren HIF-1, viss aktivering fører til en rekke cellulære tilpasninger knyttet til utvikling av terapiresistens og metabolske endringer i kreftceller. I denne studien ble effekten av hypoksi og inhibitorene everolimus og 17-AAG studert på et metabolsk nivå i multippel myelom-cellelinjen JJN-3.
Innledende studier med kartlegging av HIF-1 inhibitorer indikerte at mTOR inhibitoren everolimus og Hsp-90 inhibitoren 17-AAG ga lovende resultater, da deres tilstedeværelse førte til at mitokondriell aktivitet i JJN-3 varierte med oksygentilgangen. Videre ble det demonstrert at HIF-1α var tilstede i JJN-3 i både normoksi (21% O2) og oppregulert i hypoksi (1% O2). Hypoksiske HIF-1α nivåer var imidlertid upåvirket av tilsats av inhibitorer. Deretter ble metabolske analyser av det ekstracellulære og intracellulære metabolomet gjennomført via NMR og massespektrometriske (MS) metabolske profileringsmetoder (capIC-MS/MS og LC-MS/MS) for å undersøke effekten av hypoksi og de to inhibitorene på den sentrale karbonmetabolismen etter 24 timers inkubasjon. Det ble vist at hypoksi førte til en økning i glukoseopptak, laktatutskillelse og nivåer av glykolytiske intermediater, mens nivåene av intermediater fra sitronsyresyklusen ble redusert. Vi demonstrerte også hvordan effekten av everolimus var avhengig av oksygentilgang da nivåer av sitronsyresyklusintermediater økte i hypoksi og minket i normoksi. Imidlertid økte nivået av aminosyrer uavhengig av oksygentilgang, og det samme gjaldt reduksjon av glukoseopptak og laktatutskillelse. Effektene av 17-AAG på intermediatene av den sentrale karbonmetabolismen var uavhengige av oksygentilgang. Behandling med 17-AAG førte til redusert mitokondriell aktivitet og en økning i intermediatene fra sitronsyresyklusen, aminosyrer, pyruvat og laktat. I tillegg førte hverken oksygenvariasjon eller noen av inhibitorene til en forskjøvet energibalanse, da alle cellekulturer hadde en energiladning (?) mellom 0.65 og 0.68. For å oppsummere viser våre observasjoner hvordan den sentrale karbonmetabolismen endres av hypoksiske forhold, samt inhibering av mTOR og Hsp90.
Resultatene våre demonstrerer dermed forskjellene i hypoksisk og normoksisk metabolisme og hvordan metabolismen påvirkes av ulike signalmekanismer, et faktum som kan bidra til en økt innsikt og potensielle bruksområder i kreftcellemetabolisme som et mål for kreftmedisin. | |
| dc.description.abstract | Hypoxia is a reduced level of oxygen tension, and a phenomenon commonly occurring in malignant tumours due to poor tumour vascularisation and high proliferation rates exhausting the environment of oxygen. Through a complex signalling network, including the master regulator HIF-1, hypoxia induces cellular adaptions known to contribute to therapy resistance and altered cellular metabolism in cancer cells.
In this study, the effects of hypoxia and indirect inhibition of HIF-1 on the metabolome level were studied in the multiple myeloma cell line JJN-3.
Initial studies with screening of HIF-1 inhibitors indicated how the mTOR inhibitor everolimus and the Hsp90 inhibitor 17-AAG affected mitochondrial activity in an oxygen dependent manner. Further, it was demonstrated how HIF-1α was present in normoxia (21% O2) and upregulated in hypoxia (1% O2) in JJN-3. However, no major reduction of HIF-1α was detected upon inhibitor treatment in hypoxia. Lastly, the extracellular and intracellular metabolites were analysed through NMR and targeted mass spectrometry analysis (capIC-MS/MS and LC-MS/MS) to investigate the effect of hypoxia and the inhibitors on central carbon metabolism after 24 hours of incubation. It was shown that hypoxic incubation led to increases in glucose uptake, lactate excretion and intracellular levels of glycolytic intermediates and amino acids while intracellular levels of TCA-cycle intermediates decreased. Further, it was demonstrated how the effect of everolimus was dependent on oxygen concentration through upregulating TCA-cycle intermediates in hypoxia, with opposite effects in normoxia. However, amino acid pools were upregulated independently of oxygen concentration upon everolimus treatment, which also downregulated glucose uptake and lactate excretion independently of oxygen concentration. 17-AAG acted independently of oxygen concentration, reducing mitochondrial activity but increasing levels of TCA-cycle intermediates, amino acids, pyruvate and lactate. Notably, neither oxygen tension nor inhibitor treatment disrupted the cellular energy balance, and the energy charge was maintained between 0.65 and 0.68. In sum, these observations show how central carbon metabolism is altered upon hypoxic treatment and inhibition of mTOR and Hsp90.
Our results demonstrate how hypoxic metabolism differs from normoxic, and how it can be rewired by different signalling mechanism, thus contributing to the improved understanding and potential exploitation of cancer cell metabolism as a therapeutic target. | |