Engineering the microalga Phaeodactylum tricornutum to remediate heavy metal polluted water: An attempt to increase its heavy metal tolerance and uptake

Abstract

Tungmetallforurensning er et stort problem over hele verden og er et resultat av økende antropogeniske aktiviteter. Likevel, er de eksisterende teknologiene for fjerning av tungmetaller antatt å være dyre, ødeleggende for miljøet og ineffektive. Derfor er det et økende behov for billigere, mer øko-vennlige og effektive metoder. Bioremediering, som omhandler bruken av mikroorganismer for fjerning og/eller detoksifisering av toksiske forbindelser, har fått mye oppmerksomhet i det siste. Bruken av alger (phycoremediering) til dette formålet er et pågående hett forskningstema. I dette prosjektet har vi introdusert gener som koder for et fusjonsprotein som består av et syntetisk metallbindende peptid i den pennate diatomeen Phaeodactylum tricornutum for å øke deres toleranse for, og opptak av, tungmetaller. I tidligere eksperimenter hadde gjærceller som uttrykte dette peptidet en økt akkumulering av nikkel sammenlignet med kontroll-cellene. Derfor ble toleransen til den modifiserte P. tricornutum for nikkel studert i dette prosjektet. Vi har brukt biolistikk til å transformere P. tricornutum med to ulike konstrukt: ett som ble designet for å ha det metallbindende peptidet på den indre overflaten av plasma membranen (Inner_MeBSeq kloner), og en som skulle eksponere denne på utsiden (Outer_MeBSeq kloner). I tillegg ble tre varianter med en enkelt aminosyre-endring (MC/MM/CC) i det metallbindende peptidet testet ettersom de var predikert til å ha ulike affiniteter for ulike tungmetaller. Vi var suksessfulle med å lage Inner_MeBSeq kloner som uttrykker det metallbindende peptidet på den indre overflaten av plasmamembranen, og selv om maksimum spesifikk vekstrate K’max var litt lavere for alle klonene, viste relativ K’max at alle cellelinjene (inkludert villtype) var påvirket i liknende grad av 0.25 mg Ni2+ L-1 og 5 mg Ni2+¬ L-1. Variabel klorofyll a fluorescensmålinger indikerte at 0.25 mg Ni2+ L-1 ikke påvirket fotosyntesen til cellelinjene. Dersom videre studier bekrefter et høyere nivå av tungmetallopptak i Inner_MeBSeq klonene sammenlignet med i P. tricornutum villtype-celler, ville disse klonene være høyst interessante for videre studier med mål om å benytte disse til bioremediering. For Outer_MeBSeq klonene ble fusjonsproteinet vist å være lokalisert i ulike endomembransystemer i tillegg til cytosol, hvor bare en liten del viste seg å være lokalisert i plasmamembranen. Vi viste at veksten og fotosyntesen til både Outer_MeBSeq klonene og P. tricornutum villtype ble påvirket av 5 mg Ni2+ L-1, men at toleransen for dette tungmetallet var liknende mellom cellelinjene under de utprøvde betingelsene. Derfor ville ytterligere studier på tungmetall-binding og opptak i disse klonene være nødvendig for å kunne konkludere rundt deres anvendelighet for bioremediering.

Heavy metal water pollution is a major worldwide problem and results from an increase in anthropogenic activities. However, existing technologies for heavy metal removal are considered costly, environmentally unfriendly and inefficient. Hence, cheaper, more ecofriendly and efficient methods are needed. Bioremediation, which includes the use of microorganisms for the removal and/or detoxification of toxic compounds, has gained a lot of attention lately. The use of algae (phycoremediation) for this purpose is an ongoing hot research topic. In this project we have introduced genes encoding a fusion protein containing a synthetic metal binding peptide in the pennate diatom Phaeodactylum tricornutum to increase their heavy metal tolerance and uptake. In previous experiments yeast cells expressing this peptide had an increased accumulation of nickel compared to the control cells. Hence, the tolerance of the engineered P. tricornutum to nickel was studied in this project. We used biolistics to transform P. tricornutum with two different constructs: one that was designed to have the metal binding peptide on the inner surface of the plasma membrane (Inner_MeBSeq clones), and one that would present the peptide on the outside (Outer_MeBSeq clones). In addition, three variants of each construct with a single amino acid change (MC/MM/CC) in the metal binding peptide were tested as they were predicted to have different affinities towards different heavy metals. We were successful in creating Inner_MeBSeq clones expressing the metal binding peptide on the inner face of the plasma membrane, and although the maximum specific growth rate K’max was slightly lower for all clones, relative K’max showed all cell lines (including wild type) to be similarly affected by 0.25 mg Ni2+ L-1 and 5 mg Ni2+ L-1. Variable Chl a fluorescence measurement indicated that 0.25 mg Ni2+ L-1 did not affect the photosynthesis of the cell lines. If further studies affirm a higher level of heavy metal uptake in the Inner_MeBSeq clones than in P. tricornutum wild type cells, these clones will be highly interesting for further studies aimed at bioremediation purposes. For Outer_MeBSeq clones the fusion protein was shown to be localized in various endomembrane systems as well as cytosol, with only a small portion to be localized at the plasma membrane. We showed that the growth and photosynthesis of both Outer_MeBSeq clones and P. tricornutum wild type were affected by 5 mg Ni2+ L-1, but that the tolerance for this heavy metal was similar among the cell lines under the tested conditions. Hence, further studies on heavy metal binding or uptake by these clones would be needed in order to conclude as to their usefulness in bioremediation.