Functional studies of two silicon transporter-associated kinases in the diatom Thalassiosira pseudonana
Master thesis
Permanent lenke
https://hdl.handle.net/11250/2782505Utgivelsesdato
2021Metadata
Vis full innførselSamlinger
- Institutt for biologi [2512]
Sammendrag
Kiselalger består av en stor og mangfoldig gruppe av encellede eukaryoter. Disse organismene står for en betydelig mengde av den primære produksjonen i det marine systemet, i tillegg til at de har stor innvirkning på flere globale systemer. Kiselalger påvirker blant annet klimasystemet ved at de er med på å regulere konsentrasjonen av karbondioksid i atmosfæren, samt biologiske systemer som omrøring av karbon og næringsstoffer i havene. Celleveggen (frustulen), som består av intrikate mønstre av silisium, gjør dem veldig attraktive for studier som involverer prosesser som biomineralisering og biosyntese.
To nært beslektede kinase-kodende gener som ble studert i denne oppgaven, Tp264671 og Tp14322, ble funnet gjennom en transkriptomisk analyse. Disse to genene har vist seg å være ko-uttrykt med henholdsvis silisiumtransporter SIT1 og SIT2. Ved sammenligning av protein sekvensen til genene ble det funnet at CaMK var det katalytiske domenet, i tillegg til flere områder med konserverte aminosyrer som dukket opp i flere av sekvensanalysene av kinasedomenene.
Målet med denne oppgaven var å lage mutante cellelinjer av kiselalgen Thalassiosira pseudonana ved å slå ut genene Tp264671 og Tp14322 (samt Tp14242, en annen nær slektning) med CRISPR/Cas9-teknologien. Likheten i sekvensene til disse tre genene gjør det mulig å slå ut flere gener samtidig ved å bruke «target sites» som finnes i alle de tre genene. Ulike target sites ble satt inn i vektoren pTpPUC3-Cas9-M-G1 og overført til T. pseudonana ved konjugering via bakterien Escherichia coli. Mutant screening av algekulturene indikerte at mutasjoner hadde skjedd hos kloner som inneholdt spesifikke target sites, men Sanger-sekvensering avkreftet dette. Problemer med å etablere mutanter kan skyldes ved at genene er essensielle for at cellen skal kunne leve, eller kanskje på grunn av problemer med plasmideffektivitet (som kan kontrolleres av flere ting som plasmidkomponenter og sekvensstruktur). Genekspresjonsanalyse (sammen med mikroskopiresultater) som viste lavt uttrykk av Cas9 og sgRNA indikerte at det kanskje ikke var nok RNA til stedet for å produsere mutanter, og lavt uttrykk av nourseothricin-resistensgenet antydet at det kanskje ikke var nok antibiotika i mediet for å skape et tilstrekkelig seleksjonstrykk for T. pseudonana-kulturene.
Et annet mål var å tagge Tp264671 og Tp14322 med det fluorescerende proteinet mNeonGreen for så å sette inn genene i pTpPUC3-vektoren. Ingen av forsøkene på å oppnå dette var vellykkede, og mikroskopering av uttrykk og lokalisering av genene i T. pseudonana kunne derfor ikke gjøres. Diatoms consist of a large and diverse group of unicellular eukaryotes. These organisms are responsible for a substantial amount of the primary production in the marine environment, as well as having a great impact on several global systems. This includes the climate system by affecting the concentration of carbon dioxide in the atmosphere, as well as biological systems such as the flux of carbon and nutrients in the oceans. Their highly ornate and silicious cell wall, the frustule, makes them very attractive for studies involving processes such as biomineralization and biosynthesis.
The two closely related kinase-encoding genes that were studied in this thesis, Tp264671 and Tp14322, were found through a transcriptomics analysis. These two genes have been shown to be very closely co-expressed with silicon transporters SIT1 and SIT2, respectively. Protein alignments of the genes found that CaMK was the catalytic domain, in addition to several regions with conserved amino acids that appeared in multiple alignments of the kinase domains.
The goal of this thesis was to create mutant cell lines of the diatom Thalassiosira pseudonana by knocking out Tp264671 and Tp14322 (as well as Tp14242, another closely related kinase) with the CRISPR/Cas9 technology. The similarity in the sequences of these three genes makes it possible to knock out multiple genes at once by using target sites found in all of them. Target sites were inserted into the vector pTpPUC3-Cas9-M-G1 and transferred into T. pseudonana by bacterial conjugation. Mutant screening of the algae cultures indicated that mutations had occured for clones containing certain target sites, although Sanger sequencing confirmed no mutations had happened. Problems with establishing mutants could be due to the genes being essential for the cell to work properly, or perhaps due to issues with plasmid efficiency (which could be controlled by multiple things such as plasmid components and sequence composition). Gene expression analysis (along with microscopy results), showing low expression of Cas9 and the sgRNA, indicated that there might not have been enough mRNA from the gene-editing components of the plasmid to create knockout mutants. Low expression of the nourseothricin resistance gene implied that there might not have been enough antibiotics in the medium to create a sufficient selection pressure for the T. pseudonana cultures to keep the episome.
Another goal was to fuse Tp264671 and Tp14322 with the fluorescent protein mNeonGreen, followed by inserting the genes (with the tag) into the pTpPUC3 vector. None of the attempts to achieve this were successful and a microscopy study of expression and localization of the genes in T. pseudonana could therefore not be done.