Creation and preliminary characterization of LHCR6/LHCR8 single and double knockout strains of the diatom Phaeodactylum tricornutum

Abstract

Kiselalger er en gruppe eukaryote mikroalger som er utbredt i de fleste akvatiske habitater. Æren for den betydelige økologiske suksessen til denne gruppen kan i stor grad tildeles den eksepsjonelle lystilpasning-evnen deres. Til tross for den økologiske signifikansen deres er kunnskapen om de molekylære mekanismene bak lystilpasning i kiselalger fortsatt mangelfull. Funksjonell analyse av proteiner tilknyttet fotosyntese er et viktig steg for å øke forståelsen vår for tilpasningsprosessene. LHCR er en gruppe rødalgeliknende gener som koder for proteiner i lyshøstningskompleksene (LHC) assosiert med fotosystem I, men funksjonen til disse proteinene er ukjent. Gener i undergruppen LHCRII koder for LHC proteiner med en mulig rolle knyttet til fotobeskyttelse i sterkt lys. Som et første steg for å avdekke rollene til disse proteinene ble genene LHCR6 og LHCR8 valgt for karakterisering på grunnlag av at genuttrykket deres induseres kraftig av sterkt og/eller blått lys. LHCR6 og LHCR8 ble slått ut i kiselalge-modellorganismen Phaeodactylum tricornutum ved hjelp av CRISPR/Cas9-episomer introdusert ved bakteriell konjugasjon. Mutanter ble identifisert ved PCR-screening og HRM-analyser av de genomiske målregionene. Verifisering av at genene hadde blitt slått ut ble gjennomført ved sanger-sekvensering av målregionene. På grunn av potensielt kompenserende genuttrykk i mutanter der ett av genene var slått ut, ble dobbeltmutanter med begge genene slått ut laget ved å introdusere CRISPR/Ca9-episomet rettet mot LHCR8 i mutanter der LHCR6 allerede var slått ut. Samtidig ble det gjennomført preliminære analyser av cellevekst, klorofyllfluorescensintensitet, pigmentkomposisjon og fotosyntese-parametere for verifiserte “knockout”-mutanter og villtypen for å undersøke de mulige funksjonene til LHCR6 og LHCR8 i lystilpasning og fotobeskyttelse. Ettersom knockout av ett gen ikke medførte noen tydelige fenotypiske endringer under de fleste testede forholdene er det mulig at tap av det enkelte genet kan kompenseres for ved økt proteinproduksjon fra det andre genet og/eller fra andre LHCR-gener. Disse indikasjonene bør undersøkes på mRNA- og protein-nivå og det kan bli nødvendig å slå ut et tredje gen som induseres av sterkt og blått lys, LHCR10, for å oppnå en mer tydelig fenotype. Utstyr med evnen til å måle endringer i ytelsen til fotosystem I ved eksponering for sterkt lys, for eksempel et dual-PAM instrument, vil være nødvendig for å fullføre karakteriseringen av knockout-mutantene.

Diatoms are a group of eukaryotic microalgae, which are widespread in most aquatic habitats. Their noteworthy ecological success can in large part be attributed to their exceptional light acclimation capabilities. Despite their ecological importance, knowledge about the molecular mechanisms behind light acclimation in diatoms remains limited. An important step to improve our understanding of the acclimation process, is functional analysis of photosynthesis-related proteins. One group of proteins with roles yet to be confirmed are encoded by the red algal-like LHCR group of genes and are constituents of the light harvesting antennae complexes (LHCs) associated with photosystem I (PSI). Genes belonging to the subgroup LHCRII encode LHC proteins that have been postulated to possess specialized functions in photoprotection during exposure to excess light. To begin the elucidation of the roles of these proteins, the genes LHCR6 and LHCR8 were chosen for characterization based on their strongly induced expression in response to high intensity light (HL) and/or blue light (BL). LHCR6/8 knockout (KO) strains of the model diatom Phaeodactylum tricornutum were created using customized CRISPR/Cas9 episomes delivered by bacterial conjugation. Mutants were identified by PCR screening and high-resolution melting (HRM) analyses of genomic target regions, and gene KOs were confirmed by sanger sequencing. To account for potential compensatory expression in single KO mutants, double KO mutants were created from LHCR6 KO mutants by delivery of the LHCR8-targeting CRISPR/Cas9 episome into these strains. Meanwhile, preliminary analyses of cell growth, chlorophyll fluorescence intensity, pigment composition and photosynthetic parameters were conducted for KO mutants and wild type (WT) to investigate the potential functions of LHCR6 and LHCR8 in photoacclimation and photoprotection. Since no apparent phenotypes were observed for single KO mutants in most conditions tested, single knockout of LHCR6/8 may indeed be compensated for by the increased production of the other protein and/or by other LHCR proteins. These indications should be investigated at the mRNA and protein level, which might prove the need for creation of triple KOs by additionally targeting another HL/BL-inducible gene, LHCR10, to cause more pronounced phenotypes. To complete the characterization of the created KO strains, more advanced equipment would be required, particularly the use of dual-PAM to enable assessment of changes in PSI performance in response to excess light.