Investigation into the effects of inhibiting cytosolic phospholipase A2 alpha on the proliferation of an immortalized keratinocyte cell line (HaCaT).

Abstract

Psoriasis er en vanlig kronisk inflammatorisk sykdom som er karakterisert ved hyperproliferering og unormal differensiering av epidemis. Det er ingen kur, og det har vært lite forbedring i utviklingen av nye behandlinger for mild til moderat psoriasis det siste tiåret. For å utvikle nye og bedre behandlinger trengs det en bedre forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for utvikling av sykdommen.

I denne masteroppgaven har mekanismen bak cytosolisk fosfolipase A2α (cPLA2α) som et mål for behandling i psoriasis blitt undersøkt. Flere studier tyder på at cPLA2α regulerer G1-S fase overgangen, og at dette kan være et viktig terapeutisk mål i psoriasis, ettersom hyperproliferering er et viktig aspekt av patogenesen. Vi har undersøkt effekten av å slå ned utrykket av cPLA2α og to cPLA2α inhibitorer, AVX001 (utviklet av Coegin Pharma) og pyrrophenone, på cellesyklus regulatorer i respons til epidermal vekstfaktor (EGF) stimulering i en udødeliggjort human keratinocytt cellelinje (HaCaT). Å hemme cPLA2α ga redusert mRNA utrykk av cyclin D1 og E2 i respons til EGF, mens det ble ikke detektert noe endring i utrykk for p27Kip og p21. Den lave responsen i p27Kip utrykk i respons til EGF, mulig grunnet ufullstendig G0/G1 synkronisering, gjorde det vanskelig å tolke disse resultatene. Behandling med AVX001 og pyrrophenone resulterte i en dose-avhengig reduksjon i viabilitet, noe som ikke ble observert ved bruk av DHA, en relatert lipid forbindelse som ikke hemmer cPLA2α, noe som kan tyde på at effektene av AVX001 trolig ikke skyldes lipotoksisitet. Til slutt, ble effekten av AVX001 på proliferering av HaCaT dyrket i et stratifisert cellekultur system undersøkt. Grunnet lavt antall prolifererende celler i kontrollen og stor variasjon mellom de biologiske replikatene, kunne vi ikke trekke noen konklusjon basert på disse resultatene.

Ved å undersøke hvordan hemming av cPLA2α påvirker cellesyklus regulatorer og proliferering i et modell system for psoriasis, har cPLA2α vist seg å være et godt potensielt terapeutisk mål for å redusere hyperproliferering i psoriasis.

Psoriasis is a common chronic inflammatory disease characterized by hyperproliferation and abnormal differentiation of the epidermis. There is no cure, and there has been little improvement in development of treatments for mild to moderate psoriasis the last decade. To develop new and better treatments there is a need to get a better understanding of the molecular mechanisms behind the disease.

In this thesis the mechanisms behind how cytosolic phospholipase A2α (cPLA2α) can be a therapeutic target in psoriasis has been investigated. Several studies have implied that cPLA2α regulates the G1-S phase transition, and that this can be an important target in psoriasis, as hyperproliferation is an important aspect of the pathogenesis. We investigated the effect of knockdown of cPLA2α and of two cPLA2α inhibitors, AVX001 (developed by Coegin Pharma) and pyrrophenone, on cell cycle regulators in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation in an immortalized human keratinocyte cell line (HaCaT). Targeting cPLA2α lead to a reduction in mRNA expression of cyclin D1 and E2 in response to EGF, while no effect on the CKIs, p27Kip and p21 was detected. However, the low response in p27Kip expression in response to EGF, possibly due to incomplete G0/G1 synchronization, made it difficult to interpret these data. AVX001 and pyrrophenone treatment caused a dose-dependent reduction of viability that was not observed using DHA, a related lipid compound which does not target cPLA2α, implying the effects of AVX001 were unlikely to be due to lipotoxicity. Finally, the effect of AVX001 on proliferation of HaCaT cells grown in a stratified culture system was investigated. Due to low number of proliferative cells in the vehicle control and large variation between the biological replicates, no conclusion could be made based on these results.

By investigating how targeting cPLA2α affects cell cycle regulators and proliferation in a psoriasis model system, cPLA2α has proven to be a potential target to reduce hyperproliferation in psoriasis.