Påvisning av Crytosporidium parvum i human fæces ved PCR: Litteraturstudie

Abstract

Metodebeskrivelser for påvisning av Cryptosporidium parvum i fæcesprøver ved bruk av ulike PCR-metoder har blitt studert. Artiklene fra litteratursøket er hentet fra databasene Oria, Pubmed og Google Scholar. Søket ble begrenset til tidsperioden 2010-2020. Artiklene som er benyttet i litteraturstudien er Laude et al. (2016), Shin et al. (2018), Das et al. (2020), Mary et al. (2013), Lalonde et al. (2013), Vejdani et al. (2014), Bairami Kuzehkanan et al. (2011) og Hadfield et al. (2011). PCR er en spesifikk og sensitiv metode for påvisning av Cryptosporidium parvum. Mulitpleks real-time PCR, dupleks real-time PCR og nested PCR ble vurdert og sammenlignet med vekt på ekstraksjonsreagenser, PCR-reagenser og PCR-betingelser, samt valideringsparametrene deteksjonsgrense, sensitivitet, spesifisitet, repeterbarhet og reproduserbarhet. Real-time PCR-metodene som er undersøkt tar 48-79 min, og det benyttes prober eller smeltekurveanalyse for å påvise PCR-produktet. De undersøkte nested PCR-metodene tar 3,6-5,6 timer, og PCR-produktet visualiseres ved gelelektroforese. De undersøkte PCR-metodene har deteksjonsgrense (200-1000 oocyster/g fæces), sensitivitet (96-100%), spesifisitet (99,1-100%), repeterbarhet (97-100%) og reproduserbarhet (90,9%) for påvisning av Cryptosporidium parvum. Som supplementær PCR-metode til screeninganalyse foreslås det å benytte en kvalitativ real-time PCR med 18S rRNA som målgen for påvisning av Cryptosporidium parvum i human fæces. PCR-metoden beskrevet av Hadfield et al. (2011) er forenlig med dette. Metoden har god analytisk sensitivitet (200 oocyster/g fæces), klinisk sensitivitet (100%) og spesifisitet (99,1%) for påvisning av Cryptosporidium parvum. For ekstrahering av DNA fra fæcesprøvene foreslås QIAamp® Stool Mini Kit (Qiagen) fordi dette er en rask og enkel metode ((Shin et al., 2018), (Lalonde et al., 2013), (Vejdani et al., 2014) og (Bairami Kuzehkanan et al., 2011)). Det foreslås en to-trinns PCR med inkubering (95°C, 10 min), etterfulgt av 55 sykluser med denaturering (95°C, 15 sek), hybridisering og polymerisering (60°C, 1 min). (Hadfield et al., 2011). Til deteksjon av amplifisert PCR-produkt foreslås bruk av TaqMan MGB VIC/NFQ probe (Hadfield et al., 2011). Før den foreslåtte real-time PCR-metoden kan tas i bruk i diagnostikken må den valideres med hensyn til deteksjonsgrense, klinisk sensitivitet, diagnostisk spesifisitet, repeterbarhet, reproduserbarhet og riktighet.

Method descriptions for detection of Cryptosporidium parvum in faecal samples using different PCR methods were studied. The articles were obtained in a literature search by using the databases Oria, Pubmed and Google Scholar. The literature search was limited to the time period 2010-2020. The articles used in the literature study are Laude et al. (2016), Shin et al. (2018), Das et al. (2020), Mary et al. (2013), Lalonde et al. (2013), Vejdani et al. (2014), Bairami Kuzehkanan et al. (2011) and Hadfield et al. (2011). PCR is a sensitive and specific method for detection of Cryptosporidium parvum. Multiplex real-time PCR, duplex real-time PCR and nested PCR were evaluated and compared with emphasis on extraction reagents, PCR reagents and PCR conditions, as well as the validation parameters limit of detection, sensitivity, specificity, repeatability and reproducibility. The Real-time PCR-methods that were studied have a timespan between 48-79 min, and their methods for detection of PCR-product were probes or melt curve analysis. The nested PCR-methods have a timespan between 3,6-5,6 hours, and their method of detection is gel electrophoresis. The published articles presented the following validation results for the studied PCR-methods; limit of detection (200-1000 oocysts/g faeces), sensitivity (96-100%), specificity (99,1-100%), repeatability (97-100%) and reproducibility (90,9%). Qualitative real-time PCR targeting the 18S rRNA-gene is proposed as a complementary PCR for detection of Cryptosporidium parvum in human feaces. The PCR-method described by Hadfield et al. (2011) is compatible with this and has good results regarding analytical sensitivity (200 oocysts/g feaces), clinical sensitivity (100%) and specificity (99,1%) for detection of Cryptosporidium parvum. For extraction of DNA from feacal samples, QIAamp® Stool Mini Kit (Qiagen) is proposed because it is a rapid and simple method ((Shin et al., 2018), (Lalonde et al., 2013), (Vejdani et al., 2014) og (Bairami Kuzehkanan et al., 2011)). A two-step PCR with the following conditions: incubation (95°C, 10 min), followed by 55 cycles of denaturation (95°C, 15 sek), annealing and polymerization (60°C, 1 min), for detection of Cryptosporidium parvum is proposed (Hadfield et al., 2011). For detection of amplified product, TaqMan MGB FAM/NFQ probe is proposed (Hadfield et al., 2011). The complementary PCR-method must be validated concerning limit of detection, clinical sensitivity, diagnostic specificity, repeatability, reproducibility and accuracy of the method prior to use in a diagnostic laboratory.