Study of genes Avin5390 and Avin30120's effect on encystment properties in Azotobacter vinelandii

Abstract

Azotobacter vinelandii har den uvanlige evnen å gå inn i et metabolsk nedregulert stadie kalt en cyste. Cellen stopper de fleste metabolske aktiviteter og dekker seg selv med to beskyttende lag som forbedrer cellens motstandsdyktighet mot forskjellige former av stress. De to lagenes innhold er ikke enda blitt fullt karakterisert, men de består av blant annet polysakkarider. To genklynger, hvis funksjon hovedsakelig er relatert til produksjon av polysakkarider, har blitt observert å være oppregulerte under cystedannelse, hvilket har ført til spekulasjoner om at disse genklyngene tar del i cystedannelsen. Dette har ført til spekulasjoner om at disse genklyngene tar del i cystedannelsen. To gener i disse klyngene er Avin05390 og Avin30120.

Genenes effekt på cystedannelse ble testet ved å fjerne deler av DNA sekvensen for å deaktivere genene. Plasmider ble laget for å slette deler av og deretter å reparere de utvalgte genene via rekombinering. Dette var for å lage bakteriestamme med deaktivere og reaktiverte versjoner av genene. Bakteriestammer med deaktivert og reaktivert Avin05390 gen ble laget, men sekvensering av plasmidet dannet for å deaktivere genet indikerer at det inneholder mutasjoner som vil påvirke et annet gen i klyngen. Deaktivering av Avin30120 genet fungerte ikke.

Cystedannelse ble indusert for de produserte A. vinelandii-stammene, samt den orginale stammen. Cellene ble deretter tørket før de ble kultivert. A.vinelandii-stammen med et deaktivert Avin05390-gen overlevde tørking, noe som viser at genet ikke er essensielt for å danne cyster. Testing av cystedannelsen med de forskjellige stammene ga resultater med et for stort standardavvik til å kunne komme med en konklusjon.

Azotobacter vinelandii has an uncommon ability to enter a dormant state called a cyst. The cell halts most of its metabolic activity and covers itself in two protective layers which improves its resistance to various levels of stress. These layers consist of polysaccharides among other components, many of which are not fully characterized. Two gene clusters containing genes related to polysaccharide production have been found to be upregulated during encystment, and it was speculated that these genes might take part in the encystment process. Two such genes are Avin05390 and Avin30120.

The effect of the genes on encystment was tested by replacing parts of the genes with an antibiotic resistance marker to knock them out. A deletion and a repair plasmid were constructed for both genes with the intention of using a recombination process to inactivate and subsequently repair the genes. The deletion and subsequent repair of the Avin05390 gene was successful, but sequencing of the utilized deletion plasmid suggested it contained mutations affecting the adjacent gene. Deletion of the Avin30120 gene was unsuccessful.

Encystment was induced in the newly produced strains as well as the wild type strain. The cells were then dried before germination was induced. The strain with a deleted A.vinelandii gene demonstrated growth when cultivated during encystment, proving that the Avin05390 gene is not essential. Testing encystment for the strains with a deleted and repaired 5390 gene, as well as the wild type, gave results with standard deviations deviated too much to make any conclusions.