| dc.description.abstract | Ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi kan gener overføres mellom arter og uttrykkes i andre arter enn opphavsarten. Rekombinante proteinr brukes til en rekke formål i ulike industrier, fra mat- og tekstilindustri til terapeutisk industri. Nye bruksområder for rekombinante proteiner oppdages stadig, noe som fører til et økt behov for nye og forbedrede ekspresjonssystemer. I de siste årene har den Gram-negative Escherichia coli (E. coli) vært industriens foretrukne prokaryote vert for heterolog proteinproduksjon. Da E. coli har begrenset sekresjonskapasitet, som kompliserer nedstrøms proteinrensing, og produserer endotoksiner, som potensielt kan være en helsemessig utfordring, har fokuset blitt flyttet til de Gram-positive artene, som Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum). I de senere årene har C. glutamicum vist seg som en lovende vert for heterolog proteinproduksjon, men til sammenligning med den veletablerte E. coli, er antallet egnede ekspresjonsvektorer og systemer svært begrenset. Intensjonen med denne avhandlingen er derfor å etablere det velkjente XylS / Pm ekspresjonssystemet i C. glutamicum.
Formålet med studien var å identifisere mulige flaskehalser som begrenser ekspresjonsnivået fra XylS /Pm ekspresjonssystemet. Først ble C. glutamicum kodonoptimaliserte versjoner av velkjente reportergener (mCherry og GFP) sammenlignet med varianter kodonoptimalisert for E. coli for å undersøke om bruken av suboptimale kodon begrenset de observerte ekspresjonsnivåene. Resultatene viste at den E. coli-kodonoptimaliserte versjonen av mCherry ga det høyeste utbytte av funksjonelle proteiner. Deretter ble ekspresjonsnivået av den positive regulatoren XylS evaluert på proteinnivå. Til tross for vellykket, om enn svak, deteksjon av mCherry fra XylS /Pm ekpresjonsvektorer, ble XylS ikke detektert i C. glutamicum. Ekspresjonen av mCherry fra XylS / Pm var uavhengig av induksjon, noe som samsvarer med den manglende deteksjonen av den positive regulatoren XylS. Da ekspresjonen fra den XylS/Pm-baserte vektoren ble sammenlignet med en annen skyttelvektor for E. coli / C. glutamicum, tydet resultatene på at transkripsjonsnivået begrenset produksjonsnivået av proteinet. Samlet tydet resultatene på at transkripsjonsnivået burde øke dersom XylS fikk muligheten til å fremme ekspresjon fra XylS / Pm -systemet i C. glutamicum. Dette ble forsøkt ved å erstatte de eksisterende promotorene for xylS med promotorer fra C. glutamicum selv. Til tross for flere forsøk fungerte ikke kloningen og den ble dermed ikke fullført. | |
| dc.description.abstract | Through recombinant DNA technology, genes can be transferred between species and expressed in a non-native host. Recombinant proteins are used for various purposes in industries ranging from food and textile to biotherapeutics. As the number of applications utilizing recombinant proteins is growing, the need for novel and improved expression systems increases. For years, the Gram-negative Escherichia coli (E. coli) has been the preferred prokaryotic host for heterologous protein expression. However, due to its limited secretion capabilities that complicates and production of endotoxins that can raise safety concerns, the attention has been drawn to the Gram-positive species, such as Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum). In recent years, C. glutamicum has been reported as a promising host for heterologous protein expression. However, compared to the well-established host E. coli, the number of suitable expression vectors and systems are severely limited. Therefore, the aim of this thesis was to establish use of the well-recognized XylS / Pm expression system in C. glutamicum.
In this study, the purpose was to identify bottlenecks limiting the expression levels from the XylS / Pm expression system. First, C. glutamicum codon-optimization of common reporter genes (mCherry and GFP) was compared to E. coli codon-optimized variants to determine if use of suboptimal codons limited the expression levels observed. Results showed that E. coli codon-optimized mCherry resulted in the highest yield of functional protein. Next, expression levels of the positive regulator XylS was evaluated at protein level. Despite successful, although weak, detection of mCherry from XylS / Pm expression vectors, no XylS was detected in C. glutamicum. The expression of mCherry from XylS / Pm was independent on induction (leak expression), which corroborates with the lack of detecting the positive regulator XylS. Furthermore, when comparing expression from a vector based on XylS / Pm with an E. coli / C. glutamicum shuttle vector, results indicated that the level of transcripts is limiting the protein production levels. Together, the results suggest that transcript levels should be increased by enabling expression of XylS to improve performance of the XylS / Pm expression system in C. glutamicum. This was attempted by changing the existing xylS promoters to C. glutamicum native promoters. However, despite several attempts, the cloning work needed to generate the constructs failed and was not finished. | |
