Characterization of cerium oxide nanoparticles and their toxicity in Caenorhabditis elegans

Abstract

Målet med denne oppgaven var å undersøke toksisiteten av CeO2 nanopartikler i modellorganismen C. elegans, og å undersøke de toksiske mekanismene for en slik effekt. Selv om CeO2 nanopartikler brukes i en rekke kommersielle produkter og ender opp i miljøet, er deres økotoksikologiske risiko og mulige toksiske mekanismer ikke grundig forsket på. Eksisterende litteratur rapporterer om både toksiske og fordelaktige effekter av CeO2 nanopartikler, muligens på grunn av nanopartiklenes redoks-potensiale. Arbeidet i denne avhandlingen ble utført for å få mer innsikt i mekanismene bak disse motstridende effektene.

CeO2 nanopartikler ble først karakterisert med hensyn til størrelse og ladning. L1-stadium larver av C. elegans ble så utsatt for CeO2 nanopartikler (0, 51 − 33 mg/L) eller Ce3+ (2 − 26 mg/L), suspendert i det standardiserte testmediet moderat hardt rekonstituert vann. Etter 96 timer ble vekst, fruktbarhet og reproduksjon sammenlignet mot kontroller. Ceriumkonsentrasjonen ble målt i begynnelsen og slutten av testen for å vurdere eksponeringsbetingelsene, og i stock suspensjoner ved forskjellige tidsintervaller for å vurdere graden av agglomerering og sedimentering av nanopartikler. Oksidativ stressrespons for nematodene ble vurdert ved å teste to transgene stammer av C. elegans; reporterstammen SOD-1 og biosensorstammen GRX. Ulike testsmedier ble testet for deres effekt på nematodevekst.

Størrelsesfordelingen av nanopartiklene ble undersøkt ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi og nanopartikkelsporingsanalyse, og normalfordelingene ble vist å ha toppfrekvenser på henholdsvis 10 og 60 nm. Zeta-potensialet for CeO2 nanopartikler i eksponeringsmediet var -9,8 mV. For Ce3+-eksponering ble signifikant reduksjon i nematodeveksten målt for 4 til 26 mg/L cerium. Fertiliteten ble signifikant redusert fra 12 til 26 mg/L cerium. Reproduksjonen økte signifikant ved 2mg/L cerium, og minsket signifikant for 4 til 26 mg/L cerium. Eksponeringen av nanopartikler ga ingen signifikant endring i vekst eller fruktbarhet. For reproduksjon ble en signifikant reduksjon vist ved 4,1 og 8,0 mg/L cerium, men ikke for de høyere konsentrasjonene 16 eller 33 mg/L cerium.

Induktivt koblet plasma massespektrometri viste at eksponeringskonsentrasjonene av Ce3+ var nær de estimerte konsentrasjonene, både ved begynnelsen og slutten av toksisitetstestene. Prøver fra stock suspensjonene av CeO2 nanopartikler viste en reduksjon i ceriumkonsentrasjon med tiden, og høye variasjoner mellom prøvene. Dette indikerte at suspensjonsprotokollen ga ustabile suspensjoner, med agglomerering og sedimentering av nanopartikler. Toksisitetstesten for SOD-1 ble påvirket av problemer med nematodekulturen, og ingen konklusjoner kunne trekkes basert på de presenterte resultatene. For GRX var det ingen endring i forholdet mellom oksidert og redusert glutation etter Ce3+ eksponering, men for CeO2 nanopartikler ble en signifikant økning i forholdet observert etter 48 timers eksponering av 8,1 og 33 mg/L cerium. S-base med kolesterol produserte de lengste nematodene, etterfulgt av moderat hardt rekonstituert vann og til slutt moderat hardt rekonstituert vann med kolesterol.

Denne avhandlingen har bekreftet den potensielle giftige effekten av CeO2 nanopartikler i miljøet. Resultatene indikerer en nano-spesifikk toksisk mekanisme forårsaket av nanopartiklenes redoks-potensiale. Effekten er tilstede ved mellomstore ceriumkonsentrasjoner, og mangelen på effekt ved høyere konsentrasjoner antas å skyldes økt agglomerering av nanopaertikler. Videre arbeid bør fokusere på omfattende karakterisering av eksponeringsforholdene for å få mer innblikk i de toksiske mekanismene.

The objectives of this thesis were to investigate the toxicity of CeO2 nanoparticles in the model organism C. elegans, and to study the mechanisms of toxicity behind such effect. Although CeO2 nanoparticles are used in a range of applications and end up in the environment, their ecotoxicological risk potential and possible toxic mechanisms are not well understood. Existing literature reports both toxic and beneficial effects of CeO2 nanoparticles, possibly due to the redox-potential of the nanoparticles. The present work was performed to gain further insight into the mechanisms behind these contradictory reports.

CeO2 nanoparticles were firstly characterized with respect to size and charge. Wild type L1 stage larvae of C. elegans were then exposed to CeO2 nanoparticles (0.51 − 33 mg/L) or Ce3+ (2 − 26 mg/L), suspended in the standardized test medium moderately hard reconstituted water. After 96 h, nematode growth, fertility and reproduction was compared to controls. The cerium concentration was measured at the beginning and end of the test to assess the exposure conditions, and in stock suspensions at different time intervals to assess the degree of agglom- eration and sedimentation. Nematode oxidative stress response was assessed by toxicity tests with transgenic strains of C. elegans; the reporter strain SOD-1 and the biosensor strain GRX. Different liquid media were tested for their effect on nematode growth.

The nanoparticle size distribution was assessed using transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis, and the normal distributions were shown to have peak frequencies around 10 and 60 nm, respectively. The zeta potential of CeO2 nanoparticles in the exposure medium was -9.8 mV. For Ce3+ exposure, significant decrease in the growth of the nematodes was measured for 4 to 26 mg/L cerium. Fertility was significantly decreased from 12 to 26 mg/L cerium. Reproduction was significantly increased at 2 mg/L cerium, and significantly decreased for 4 to 26 mg/L cerium. CeO2 nanoparticle exposure caused no significant change in growth or fertility. For reproduction, a significant decrease was shown at 4.1 and 8.0 mg/L cerium, but not for the higher concentrations of 16 or 33 mg/L cerium.

Inductively coupled plasma mass spectrometry showed that the exposure concentrations of cerium were close to the estimated concentrations, both at the beginning and end of the wild type toxicity test. Samples from nanoparticle stock suspensions showed a decrease in cerium concentration with time, and high variations between samples. This indicated that the suspension protocol produced unstable suspensions, with nanoparticle agglomeration and sedimentation. SOD-1 assays were affected by nematode culture issues, and no conclusions could be drawn based on the presented results. For GRX, there was no change in the oxidized over reduced ratio of glutathione after Ce3+ exposure, but for CeO2 nanoparticles a significant increase in the ratio was seen after 48 h exposure to 8.1 and 33 mg/L cerium. S-base with cholesterol produced the longest nematodes, followed by moderately hard reconstituted water and lastly moderately hard reconstituted water with cholesterol.

This work has confirmed the potential toxic effect of CeO2 nanoparticles in the environment. The results indicate a nano-specific toxic mechanism caused by the redox-potential of the nanoparticles. The effect is present at intermediate concentrations, and the lack of effect at higher concentrations is assumed to be due to increased nanoparticle agglomeration. Further work should focus on comprehensive characterization of the exposure conditions to gain further insight into the toxic mechanisms.