Functional validation of Frizzled-7 as a potential molecular target in glioblastoma multiforme

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) er en svært alvorlig type kreft, men en median overlevelsestid på kun 14 måndeder etter at diagnose er satt, selv om standard behandling igangsettes. Derfor er det et stort behov for nye terapeutiske tilnærminger for behandling av dennekreftformen. Å rette behandlingen mot en tumor sub-populasjon av kreftstamceller, og signalveier sentrale for levedyktighet i disse cellene, har blitt fremlagt som en lovende tilnærming ved behandling av denne typen kreft. Wnt-signalveien, trolig involvert i regulering av sentrale funksjoner i kreftstamceller, har vist seg å være svært dysregulert i GBM, og kan dermed være et mulig terapeutisk mål.

Formålet med denne studien var å funksjonelt validere knock-down av Frizzled-7 (Fzd7), en Wnt-signalvei reseptor, ved bruk av CRISPR/Cas9 teknologi. Først skulle protokoll for knock-down etableres ved å slå ut av et funksjonelt kontroll gen, serum-glucocorticoid regulated kinase 1 (SGK1) i en pasient-derivert glioblastomstamcelle kultur. Deretter skulle den etablerte protokollen brukes til å utforske effekten av FZD7 knock-down ved bruk av CRISPR/Cas9 i fire pasient-deriverte glioblastomstamcelle kulturer. Studien ble gjennomført ved lentiviral introduksjon av Cas9 og sgRNAer, rettet mot kodete regioner i det gitte genet, etterfulgt av evaluering av CRISPR/Cas9 activitet på DNA nivå ved T7 endonuclease assay, på mRNA nivå ved RT qPCR, på protein nivå ved Western blot, og på viabilitet og funksjonelt ved XTT viabilitet test.

Det ble funnet at CRISPR/Cas9 knock-down av SGK1 delvis validerte funksjonaliteten av CRISPR/Cas9 systemet ved å vise suksessful og spesifikk indusjon av indels og nedgang i viabiltet, samtidig som å sub-optimal indusering av indels samt en potensiell usikkerhet i protein knock-out fra et av sgRNAene. Videre viste CRIPSR/Cas9 knock-down av FZD7 i fire pasient-deriverte glioblastomstamcelle kulturer en uventet økning i viabilitet i alle cellekulturer. Dette kan skyldes kompensasjonsmekanismer mellom Fzd7 og andre proteiner, eller uforutsette DNA-skade responser. Knock-down av FZD7 viste også sub-optimal indusering av indels og variasjoner i FZD7 gen- og protein ekspresjon mellom de ulike kulturene. Bare en av fire kulturer viste både redusert mRNA og protein utrykk, som er ønsket etter CRIPSR/Cas9 aktivitet. Responsene på mRNA og protein nivå fremhevet vanskeligheter i å forutsti effekter av celle regulering, og tumor heterogenitet i respons etter CRIPSR/Cas9 knock-down av FZD7. Dypere forståelse av Wnt-signalveien og andre sentral signalveier for viabilitet i kreftstamceller, og utforskning av spesifikke molekylære målgener eller proteiner burde gjennomføres for å identifisere og validere funksjonelle mål i GBM behandling. I tillegg, dypere forståelse av CRIPSR/Cas9 effekter i glioblatomstamceller og optimalisering av CRIPSR/Cas9 protokoller og design, burde også gjøres for å øke CRISPR/Cas9 knock-down effekt.

Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most devastating cancers with a mean survival time following diagnosis of only 14 months, even when standard treatment is given. Thus, there is a pressing need for novel therapeutic approaches to treat this cancer. Targeting the tumor sub-populations of cancer stem cells (CSCs), and pathways important for viability in these cells, have been proposed as a promising approach to treat this cancer. The Wnt-pathway, believed to regulate central characteristics of CSCs, has shown to be highly dysregulated in GBM, and could thus serve as a potent therapeutic target.

The aim of this study was to functionally validate knock-down of the Wnt-pathway receptor, Frizzled (Fzd7), using CRISPR/Cas9 technology, by first establishing protocol conditions for knock-down and viability assays targeting a functional control gene (SGK1) in one patient-derived primary GSC culture. Knock-down assays included evaluation of knock-down effect at the level of DNA, mRNA and protein. Second, the established protocol conditions were applied to explore CRISPR/Cas9-mediated knock-down of Fzd7 in four patient-derived primary GSC cultures. The study was done by lentiviral introduction of Cas9 and sgRNAs targeting the coding region of the gene of interest, followed by evaluation of CRISPR/Cas9 activity at DNA level by T7 endonuclease assay, at mRNA level by RT qPCR, at protein level by Western blot, and at viability by XTT assay.

It was found that CRISPR/Cas9-mediated knock-down of SGK1 partly validated the functionality of the CRISPR/Cas9 system by indicating successful and specific indel induction and decreased viability, though showcasing sub-optimal indel inductions and a potential uncertainty regarding protein knock-out from one of the sgRNAs. Further CRISPR/Cas9-mediated knock-down of FZD7 in four patient-derived GSC cultures unexpectedly showed increased viability in all cell cultures. This could be due to redundancy effects between Fzd7 and other proteins, or unaccounted for DNA damage responses. Knock-down of FZD7 also showcased sub-optimal DNA indel inductions and variations in Fzd7 gene and protein expression between the different tumors. Only one of four GSC cultures showcased both decreased mRNA and protein levels, as is desired following CRISPR/Cas9 activity. Responses on mRNA and protein level highlighted difficulties in predicting effects of cell regulation, and tumor heterogeneity in responses to CRISPR/Cas9-mediated Fzd7 knock-down. Further understanding of the Wnt-pathway and other central pathways for cancer stem cell viability, and exploration of specific molecular targets should be done in order to identify and validate functional targets for GBM treatment. Additionally, further understanding of CRIPSR/Cas9 effects in GSCs and optimization of CRISPR/Cas9 protocols and designs, should also be done in order to increase CRISPR/Cas9-mediated knock-down effects.