Etablering av real-time PCR for påvisning av eksfoliativt toksin A og B

Abstract

Staphylococcal Scalded Skin Syndrome (SSSS) er en potensielt alvorlig sykdom der påvisning av Staphylococcus aureus-toksinene ETA og ETB er en sentral del av diagnostikken. Avdeling for medisinsk mikrobiologi ved St. Olavs Hospital ønsket å erstatte en konvensjonell PCR-metode med en mindre tidkrevende metode, som real-time PCR med TaqMan®-probe for deteksjon av toksingenene. En slik metode vil korte ned svartiden og forenkle arbeidsflyten i laboratoriet. Dette ble testet ved å utføre PCR under forskjellige betingelser. Fast PCR ble prøvd ut som et alternativ til den opprinnelige konvensjonelle metoden. Det ble bestilt nye primere og prober, og de nye primerne ble sammenliknet med de opprinnelige primerne ved bruk av SYBR Green før real-time med probe ble prøvd ut. Real- time PCR med TaqMan®-probe var vellykket og kunne også utføres i multiplex. Spesifisitet og sensitivitet ble beregnet samt analyse av direktemateriale. Deteksjonsgrensen ble testet ved bruk av NaCl-suspensjon av en S. aureus-stamme positiv på eta og etb. Resultatene viste en deteksjonsgrense på 6,564 kopier per PCR for eta og 3,219 kopier per PCR for etb. Dette tyder på at metoden er meget sensitiv og gir mulighet for påvisning av toksinene også direkte fra klinisk materiale. Den opprinnelige konvensjonelle metoden ble utført på eluat fra bakteriekoloni og behøvde derfor et døgn dyrkning i tillegg til analysetiden. Ved overgang til en real-time multiplexmetode med TaqMan®-probe utført på eluat fra direktemateriale blir analysetiden kortet ned betraktelig i tillegg til at dyrkning ikke er nødvendig. Dette betyr at svartiden til rekvirent, antall analyseoperasjoner og reagensforbruk blir betydelig mindre ved eventuell overgang til en slik metode.

Staphylococcal Scalded Skin Syndrome (SSSS) is a potentially sevre disease, where detection of the Staphylococcus aureus toxins ETA and ETB are essential to the diagnostics. The Department of Medical Microbiology at St. Olavs Hospital in Trondheim desired to replace a time consuming and laborious conventional PCR with a real time PCR with TaqMan®-probe for detection of the eta and etb genes. This was done by testing PCR under different conditions. Fast PCR was tested as an alternative to the original conventional method. New primers and probes were ordered and the new primers were compared with the original primers using SYBR Green before a real-time with probes was tested. The real-time PCR with TaqMan®-probe was successful and could also be executed in multiplex. Specificity and sensitivity were calculated and also the analysis of patient material (ESwabTM) was done. The detection limit was tested with a NaCl-suspension of a S. aureus strain positive for eta and etb. The results showed a detection limit of 6,564 copies per PCR for eta and 3,219 copies per PCR for etb. This indicates that the method is highly sensitive and opens the possibility of performing the analysis directly on extracted patient material. The original conventional method was executed on extracted colony material and thus needed 24 hours of incubation before extraction in addition to the analysis time. With a transition to a real-time multiplex method with TaqMan®-probe executed on extracted patient material, the analysis time is shortened a significant amount in addition to the lack of incubation time. This means that the doctor gets the results faster and the number of analysing operations and reagents are much less with a transition to this type of method.