En sammenligning av metoder som måler konsentrasjon og kvalitet av RNA isolert fra T-lymfocytter i blod

Abstract

Hensikten med denne oppgaven var å utføre en metodesammenligning for å undersøke om SPARK plateleser kan erstatte allerede eksisterende metoder for RNA-konsentrasjonsmåling. Det ble innhentet prøvematerialet (heparinblod) fra åtte blodgivere. T-lymfocyttene i blodet ble dyrket før høsting og isolering av RNA. Isoleringen ble utført på den automatiserte isoleringsroboten QIAsymphony. I tillegg til å bli brukt i metodesammenlikningen ble de isolerte RNA-prøvene lagret for senere å kunne brukes som kontrollprøver til RNA analyser.

Til metodesammenligningen ble det til sammen brukt 56 prøver. Åtte prøver fra blodgivere og 48 prøver som allerede var ferdig isolert. RNA-konsentrasjon til alle prøver ble målt med fem ulike metoder: Nanodrop ND-1000 (absorbans), Qubit (fluorometri), SPARK (absorbans og fluorometri) og Agilent 2100 Bioanalyzer. På absorbansmålingene får en i tillegg til konsentrasjon, ut en ratio, som sier noe om renheten av RNA-et. Agilent Bioanalyzer oppgir også en RIN-verdi, som sier noe om hvor degradert RNA-et er. SPARK plateleser har to ulike moduler, en absorbansmodul (NanoQuant-plate) og en fluorescensmodul. Absorbansmodulen ble først sammenlignet med nanodrop ND-1000, som er metoden som brukes i rutinen i dag. Fluorescensmodulen ble sammenlignet med Qubit fluorometer. Tilslutt ble begge modulene sammenlignet med Agilent 2100 Bioanalyzer.

Absorbansmodulen til SPARK viser god korrelasjon med referansemetoden (Nanodrop), men T-test, regresjon og differanseplotet viser en systematisk proporsjonal feil som ikke kan godtas. Fluorescensmodulen til SPARK viser ikke god nok korrelasjon med referansemetoden (Qubit). I tillegg viser differanseplotet og T-test en konstant systematisk feil. Den konstante feilen kan godkjennes ut ifra regresjonen. Det vil her være nødvendig å gjøre en vurdering i forhold til kravet for % bias. Sammenlignet med Agilent 2100 Bioanalyzer viser begge modulene dårlig korrelasjon, i tillegg til et betydelig konstant og proporsjonalt systematisk avvik. På bakgrunn av metodesammenligningen må det konkluderes med at verken NanoQuant-platen eller fluorescensmodulen til SPARK kan erstatte de eksisterende måleinstrumentene Nanodrop, Qubit og Agilent.

The purpose of this assignment was to compare different methods for RNA concentration measurement, to explore whether SPARK plate reader can replace already existing methods. Heparin blood from eight blood donors was obtained. The T lymphocytes in the blood were cultured prior to harvesting and isolation of the RNA. The extraction prosses was performed by the automated extraction robot, QIAsymphony. In addition to being used in the method comparison, the isolated RNA was stored for later to be use as control samples in RNA assays.

For the method comparison, a total of 56 samples were used. Eight samples from blood donors and 48 samples that had already been isolated. RNA concentration in the samples was measured using five different methods: Nanodrop ND-1000 (absorbance), Qubit (fluorometry), SPARK (absorbance and fluorometry) and Agilent 2100 Bioanalyzer. For the absorbance methods the result includes a ratio, in addition to the RNA concentration, which indicate the purity of the RNA. Agilent Bioanalyzer also states a RIN value, which indicate how degraded the RNA might be. SPARK plate reader has two different modules, one absorbance module (NanoQuant plate) and one fluorescence module. The absorbance module was first compared with nanodrop ND-1000, which is the method used in the routine today. The fluorescence module was compared with the Qubit fluorometer. Finally, both modules were compared with Agilent 2100 Bioanalyzer.

The absorbent module shows good correlation with the reference method (Nanodrop), but T-test, regression and difference plot show a systematic proportional error that cannot be accepted. The fluorescence module does not show good enough correlation with the reference method (Qubit). In addition, difference plot and T-test show a constant systematic error. The constant error can be approved according the regression. At this point it will be necessary to look at how big a fault can be allowed compared to the % bias. Compared to Agilent 2100 Bioanalyzer, both modules show poor correlation, in addition to a significant constant and proportional systematic deviation. Based on the method comparison, the conclusion is that neither the NanoQuant plate nor the fluorescence module of SPARK can replace the existing instruments for RNA concentration measurement.